[發明專利]柑橘鱗皮病毒的RT-LAMP檢測試劑盒和方法

在審

• 申請號: 201810596969.8
• 申請日: 2018-06-11
• 公開（公告）號: CN108441582A
• 公開（公告）日: 2018-08-24
• 發明（設計）人: 曹孟籍;李敏;李中安
• 申請（專利權）人: 西南大學
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6844;C12R1/94
• 代理公司: 重慶市前沿專利事務所(普通合伙) 50211
• 代理人: 鄒曉艷

本發明公開了一種柑橘鱗皮病毒的RT?LAMP檢測試劑盒，包括引物對F3?5/B3?5和FIP3?5/BIP3?5，序列為：F3?5:5’?CTTTGAGTCCATCAACTGTT?3’，B3?5:5’?TCACTCTGAAGCTGACAT?3’，FIP?5:5’?GGTGAAGGACCAACTAGGACGTTGCTGAAATCTGCCTC?3’,BIP?5:5’?GAAACCCCTTGTTCTTGTCGGGTGCTATAATTTACAGCCTCA?3’。還公開了柑橘鱗皮病毒的RT?LAMP檢測方法，提取樣品總RNA，利用前述試劑盒進行RT?LAMP擴增，58～68℃擴增40～80min。

技術領域

本發明屬于分子生物學技術領域，具體涉及一種柑橘鱗皮病毒的RT-LAMP檢測試劑盒和方法。

背景技術

柑橘鱗皮病毒(Citrus psorosis virus，CPsV)是一種對柑橘具有毀滅性的病害，該病自20世紀90年代在美國佛羅里達州和加利福尼亞州被首次發現以來，相繼在阿根廷、西班牙、埃及、意大利等國家廣泛發生(Roistacher，1993)。柑橘鱗皮病主要危害甜橙、葡萄柚和寬皮柑橘，可引起寄主主干和大枝典型的樹皮鱗片狀開裂癥狀，并伴隨木質部導管充膠變色，感染該病毒的樹木產量只有健康樹木產量的28％(Achachi et al.，2014)。柑橘鱗皮病主要通過嫁接進行傳播(Martín et al.，2002)，卵菌亞綱的油壺菌也可以傳播CPsV(Palle et al.，2005；Vaira et al.，2007,2009)。柑橘鱗皮病有鱗皮病A(PsA)和鱗皮病B(PsB)兩種類型，其中以PsA最為常見。PsA可引起植株主干樹皮鱗片化開裂，木質部導管充膠變色。PsB的危害比PsA嚴重，主要引起嫰枝充膠，樹皮大面積開裂，老葉上形成變色環斑，有時沿葉脈可見褪綠斑紋(Velázque et al.，2012)，10-20樹齡的樹木較易出現樹皮鱗皮狀開裂(Achachi et al.，2014)。

在田間樣品大規模檢測過程中發現我國田間有該病毒的分布，而目前關于CPsV的檢測主要是通過ELISA、分子雜交，RT-PCR和免疫電鏡等方法(Martín et al.，2004；Achachi et al.，2015)，其中RT-PCR的方法需要昂貴的檢測儀器，且靈敏度需要進一步的提高；ELISA、分子雜交和免疫電鏡的方法操作費事，且靈敏度低。環介導等溫核酸擴增(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)技術是采用4條特異引物和DNA鏈置換聚合酶(Bst DNApolymerase)在恒溫條件下建立的一種新型的分子檢測技術(Notomi etal.,2000)，現已廣泛的應用于各種病原微生物的檢測(Okuda et al.，2015；Rudolph etal.，2015；Warghane et al.，2017；Lu et al.，2018)。

發明內容

針對上述技術問題，本發明旨在提供一種簡單、方便、快捷、靈敏度高的柑橘鱗皮病毒的RT-LAMP檢測試劑盒和方法。

為此，本發明所采用的技術方案為：

一種柑橘鱗皮病毒的RT-LAMP檢測試劑盒，包括外引物對F3-5/B3-5和內引物對FIP3-5/BIP3-5，所述內、外引物對的序列為：

F3-5:5’-CTTTGAGTCCATCAACTGTT-3’，

B3-5:5’-TCACTCTGAAGCTGACAT-3’，

FIP-5:5’-GGTGAAGGACCAACTAGGACGTTGCTGAAATCTGCCTC-3’，

BIP-5:5’-GAAACCCCTTGTTCTTGTCGGGTGCTATAATTTACAGCCTCA-3’。

在上述技術方案中，還包括LAMP Kit。