[發(fā)明專利]一種下一代測序文庫的制備方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810596876.5
• 申請日: 2018-06-11
• 公開（公告）號: CN108866155B
• 公開（公告）日: 2022-07-26
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 常玉曉;穆建強;趙勝;盧穎;劉可
• 申請（專利權(quán)）人: 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院深圳農(nóng)業(yè)基因組研究所
• 主分類號: C12Q1/6806
• 分類號: C12Q1/6806;C12N15/10;C40B50/06
• 代理公司: 北京華仲龍騰專利代理事務(wù)所(普通合伙) 11548
• 代理人: 李靜

本發(fā)明公開了一種下一代測序文庫的制備方法。按照如下步驟進行：DNA定量，在待測DNA片段的兩端加上測序時需要的DNA接頭序列，DNA文庫的濃度和DNA片段長度分布模式的檢測，DNA文庫混合比例的計算和混合，混合文庫的片段選擇，被選擇DNA文庫的檢測和定量，被選擇DNA文庫的測序。本發(fā)明的方法將多個文庫在PCR后混合在一起進行一次片段分選和Q?PCR定量，大大的降低了工作量，而且最終的測序數(shù)據(jù)量在不同樣品中的分布沒有受到顯著影響。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種下一代測序文庫的制備方法。

背景技術(shù)

2015年10月，隨著Illumina公司宣布將HiSeq X^TM測序系統(tǒng)的應(yīng)用擴展到非人物種的全基因組測序后，新一代測序(Next-Generation Sequencing，NGS)的成本大幅度下降；2017年1月9日，測序巨頭企業(yè)Illumina公司在著名的JP摩根健康大會上發(fā)布了新的測序系統(tǒng)NovaSeq^TM系列儀器，并聲稱該儀器一次運行的試劑成本比HiSeq X^TM低30％，但是數(shù)據(jù)產(chǎn)出量是HiSeq X^TM的3倍，使得未來人類基因組測序的價格進一步降至100美元。HiSeq X^TM和NovaSeq^TM的推出，也使眾多物種的大規(guī)模群體重測序項目成為可能。然而，與測序環(huán)節(jié)技術(shù)的快速進步相比，測序文庫的構(gòu)建技術(shù)在過去的十年中鮮有實質(zhì)性的改進和提高，這一點很大程度上限制了NGS的廣泛應(yīng)用，尤其是樣品數(shù)量多時，測序文庫的構(gòu)建這一步往往成為項目周期和成本的限制因素。

測序文庫構(gòu)建的流程包含三個步驟：第一步，在待測DNA片段的兩端加上測序時需要的DNA接頭序列；第二步，DNA文庫片段選擇；第三步，DNA文庫中有效DNA片段的準確定量。

在第一個步驟中，目前有兩大類在待測DNA片段的兩端加上測序時需要的DNA接頭序列的方法。第一類一般稱為Truseq文庫，其大致流程如下：1.根據(jù)準備測序的讀長，將基因組DNA打斷成峰值在300-500bp、但范圍彌散分布于200-1000bp的小片段；2.將這些小片段DNA經(jīng)過末端修復(fù)、加腺嘌呤脫氧核糖核苷酸(dATP)尾巴后形成3’端帶dATP尾巴的雙鏈DNA分子；3.將3’端帶dATP尾巴的雙鏈DNA分子和5’端帶胸腺嘧啶脫氧核糖核苷酸(dTTP)的Truseq接頭連接；4.根據(jù)需要可以用通過聚合酶鏈式反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction,PCR)擴增連接了接頭的DNA片段，或者不用PCR擴增而構(gòu)建PCR-free的測序文庫。另一類在待測DNA片段的兩端加上測序時需要的DNA接頭序列的方法一般稱為轉(zhuǎn)座酶文庫。轉(zhuǎn)座酶文庫利用Tn5轉(zhuǎn)座酶復(fù)合體可以隨機切割DNA分子并在切割的位置連接上測序接頭的特性，把構(gòu)建Truseq文庫過程中的DNA打斷、末端修復(fù)、加dATP尾巴、接頭連接等過程通過一次轉(zhuǎn)座酶反應(yīng)完成，大大的簡化了文庫構(gòu)建的過程。接頭連接上以后，和Truseq文庫構(gòu)建一樣，通過PCR擴增獲得轉(zhuǎn)座酶文庫。

在第一個步驟完成后，無論是Truseq文庫還是轉(zhuǎn)座酶文庫，其DNA片段的范圍都是彌散的分布于大概200-1000bp，因此需要測序文庫構(gòu)建流程中的第二個步驟，即根據(jù)測序長度選取跨度大約為100bp的DNA片段進行后續(xù)測序反應(yīng)。比如，如果目的測序長度為雙末端150bp(Pair End 150bp)，則選擇長度為420-520bp(插入片段約300bp，加上兩端的接頭長度約120-160bp)的DNA片段；如果目的測序長度為雙末端250bp(Pair End 250bp)，則選擇長度為620-720bp。目前一般用磁珠或瓊脂糖凝膠切膠的方法選擇目的DNA片段，也可以利用Life technology公司開發(fā)的預(yù)制瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)或Sage Science公司開發(fā)的系列儀器(Sage BluePippin、Sage ELF或Sage PippinHT)進行DNA文庫片段選擇。