[發(fā)明專利]一種下一代測(cè)序文庫(kù)的制備方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810596876.5
• 申請(qǐng)日: 2018-06-11
• 公開（公告）號(hào): CN108866155B
• 公開（公告）日: 2022-07-26
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 常玉曉;穆建強(qiáng);趙勝;盧穎;劉可
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院深圳農(nóng)業(yè)基因組研究所
• 主分類號(hào): C12Q1/6806
• 分類號(hào): C12Q1/6806;C12N15/10;C40B50/06
• 代理公司: 北京華仲龍騰專利代理事務(wù)所(普通合伙) 11548
• 代理人: 李靜

1.一種下一代測(cè)序文庫(kù)的制備方法，其特征在于，按照如下步驟進(jìn)行：

（1）DNA定量：將抽提的基因組DNA取2-5μL，測(cè)定基因組DNA的濃度；

（2）在待測(cè)DNA片段的兩端加上測(cè)序時(shí)需要的DNA接頭序列；

（3）DNA文庫(kù)的濃度和DNA片段長(zhǎng)度分布模式的檢測(cè)；

（4）DNA文庫(kù)混合比例的計(jì)算和混合：根據(jù)每個(gè)文庫(kù)的濃度和該文庫(kù)中目標(biāo)片段占的比例，兩者相乘即得到該文庫(kù)中目標(biāo)片段的濃度，該濃度信息是不同DNA文庫(kù)混合的依據(jù)；根據(jù)目標(biāo)片段的濃度，從每個(gè)文庫(kù)都取相同總量的目標(biāo)DNA進(jìn)行混合，獲得最終混合的文庫(kù)；

（5）混合文庫(kù)的片段選擇：將混合好的文庫(kù)進(jìn)行片段選擇，利用瓊脂糖凝膠切膠回收目的DNA片段的方法、E-Gel預(yù)制瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)、Sage BluePippin、Sage ELF或SagePippinHT，進(jìn)行DNA文庫(kù)片段選擇，獲得被選擇DNA文庫(kù)片段；

（6）被選擇DNA文庫(kù)的檢測(cè)和定量：采用Fragment analyzer、Agilent Bioanalyzer2100或Qsep100檢測(cè)被選擇文庫(kù)的實(shí)際片段大小；文庫(kù)的定量采用Qubit、PicoGreen或Q-PCR來測(cè)定；

（7）被選擇DNA文庫(kù)的測(cè)序：根據(jù)文庫(kù)的濃度，按照Illumina相關(guān)儀器的要求，上機(jī)測(cè)序；

步驟（2）中，所述在待測(cè)DNA片段的兩端加上測(cè)序時(shí)需要的DNA接頭序列的方法有2種，第一種方法是將基因組DNA利用超聲波打斷，然后對(duì)其進(jìn)行末端修復(fù)、加A尾巴，然后利用連接酶將DNA接頭連接到基因組DNA片段上并通過PCR擴(kuò)增得到文庫(kù)；第二種方法是利用Tn5轉(zhuǎn)座酶復(fù)合體將DNA打斷并連接上DNA接頭序列；

步驟（3）中，所述DNA文庫(kù)的濃度采用Qubit或PicoGreen的方法來測(cè)定；所述DNA片段分布模式采用Fragment analyzer、Agilent Bioanalyzer 2100或Qsep100來檢測(cè)。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述下一代測(cè)序文庫(kù)的制備方法，其特征在于，步驟（1）中，測(cè)定基因組DNA的濃度采用基于熒光染料的DNA濃度測(cè)定方法，所述基于熒光染料的DNA濃度測(cè)定方法為Qubit或PicoGreen。