[發(fā)明專利]一種通過(guò)細(xì)胞表面標(biāo)記特異性富集的人乳牙干細(xì)胞亞群及其干性檢測(cè)方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810596347.5
• 申請(qǐng)日: 2018-06-11
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN108753696A
• 公開(kāi)（公告）日: 2018-11-06
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 徐隨民
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 南京泰盛生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C12N5/074
• 分類號(hào): C12N5/074;C12Q1/02;C12N15/867;A61L27/38;A61L27/54
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1.一種通過(guò)細(xì)胞表面標(biāo)記特異性富集的人乳牙干細(xì)胞亞群，其特征在于，所述干細(xì)胞為人乳牙干細(xì)胞，所述的人年齡是5至8歲，所述細(xì)胞表面標(biāo)記選自CD18，STRO-1，CD106/VCAM-1，CD146/MUC-18，HOP-26，CD49A/整合素β1，SB-10/CD166中的一個(gè)或多個(gè)。

2.權(quán)利要求1所述的人乳牙干細(xì)胞亞群，其特征在于，以CD18作為細(xì)胞表面標(biāo)記，所述CD18使用熒光標(biāo)記或磁珠標(biāo)記。

3.一種權(quán)利要求1或2所述人乳牙干細(xì)胞亞群的富集方法，其特征在于，所述方法的具體步驟如下：

步驟1，收集正常脫落的兒童乳切齒，立即置于4℃預(yù)冷的含50-300U/mL青霉素、50-300μg/mL鏈霉素、和1-5μg/mL二性霉素B的α-MEM培養(yǎng)基中，2℃-8℃條件下運(yùn)至潔凈實(shí)驗(yàn)室，從收集到開(kāi)始提取乳牙干細(xì)胞的時(shí)間間隔不超過(guò)72小時(shí)；

步驟2，轉(zhuǎn)移至生物安全柜，取出乳切齒至培養(yǎng)皿，用4℃預(yù)冷的無(wú)菌磷酸鹽緩沖液清洗，即PBS清洗其外表面；

步驟3，從殘存的牙冠中分離出牙髓組織；步驟4，將牙髓組織置于含1-10 mg/ml I型膠原酶和1-10 mg/ml分散酶的PBS中，37℃消化1小時(shí)；

步驟5，將消化液通過(guò)70微米的細(xì)胞篩過(guò)濾，獲得含有人乳牙干細(xì)胞的單細(xì)胞懸液，900rpm離心5min，用PBS洗細(xì)胞一次；

步驟6，用PBS重懸細(xì)胞，加入CD18單抗，混勻，室溫避光孵育30分鐘；

步驟7，洗滌后，900rpm離心5min，用PBS重懸細(xì)胞；

步驟8，通過(guò)流式細(xì)胞儀分選或免疫磁珠分選，獲得CD18陽(yáng)性干細(xì)胞亞群。

4.一種權(quán)利要求1或2所述人乳牙干細(xì)胞亞群的干性檢測(cè)方法，其特征在于，所述方法的具體步驟如下：

步驟1，取富集的CD18陽(yáng)性干細(xì)胞亞群，計(jì)數(shù)；

步驟2，900rpm 離心5min；

步驟3，用含10％-20% 胎牛血清、50μM-200μM的抗壞血酸2-磷酸酯、2mM谷氨酰胺、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的α-MEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞；

步驟4，將10⁴個(gè)CD18陽(yáng)性干細(xì)胞接種于T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5％ CO₂的孵箱中培養(yǎng)；

步驟5，每3-4天換液，14-16天后，倒掉培養(yǎng)液，PBS清洗貼壁細(xì)胞，隨后用含有0.1%甲苯胺藍(lán)和2%多聚甲醛的PBS溶液進(jìn)行固定、染色。

5.一種權(quán)利要求1或2所述人乳牙干細(xì)胞亞群的干性檢測(cè)方法，其特征在于，所述方法的具體步驟如下：

步驟1，取富集的CD18陽(yáng)性干細(xì)胞亞群，計(jì)數(shù)；

步驟2，900rpm 離心5min；

步驟3，用含10％-20% 胎牛血清、50μM-200μM的抗壞血酸2-磷酸酯、2mM谷氨酰胺、100U/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素的α-MEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞；

步驟4，將步驟3得到的細(xì)胞以10⁴每孔接種于12孔板中，置于37℃、5％ CO₂的孵箱中培養(yǎng)；

步驟5，培養(yǎng)1-2天后，加入Brdu試劑，所述Brdu試劑，孵育24h；

步驟6，Brdu染色試劑盒對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色；蘇木素復(fù)染；鏡下計(jì)數(shù)陽(yáng)性干細(xì)胞數(shù)，測(cè)定所述干細(xì)胞的增殖率。