[發(fā)明專利]一種通過細(xì)胞表面標(biāo)記特異性富集的人乳牙干細(xì)胞亞群及其干性檢測方法

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• 申請日: 2018-06-11
• 公開（公告）號: CN108753696A
• 公開（公告）日: 2018-11-06
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 徐隨民
• 申請（專利權(quán)）人: 南京泰盛生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/074
• 分類號: C12N5/074;C12Q1/02;C12N15/867;A61L27/38;A61L27/54
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本發(fā)明提供了一種特異的人乳牙干細(xì)胞亞群及其富集方法。本方法包含牙組織樣品的采集運(yùn)輸，乳牙干細(xì)胞的分離，及表達(dá)CD18干細(xì)胞的富集。本發(fā)明還提供了一種富集的乳牙干細(xì)胞亞群生物學(xué)特性的檢測方法。包括與干性相關(guān)的集落形成能力檢測，增殖能力檢測，體外成骨分化能力檢測，體內(nèi)成骨分化能力檢測。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種通過細(xì)胞表面標(biāo)記，優(yōu)選CD18特異性富集的人乳牙干細(xì)胞亞群及其干性檢測方法。本發(fā)明也涉及將通過本發(fā)明富集的細(xì)胞用于再生醫(yī)學(xué)的用途。

背景技術(shù)

人的一生中，先后有兩副牙發(fā)生。乳牙是人的第一副牙齒，共20顆。從出生后6個月左右開始萌出，到3歲時基本長齊。恒牙是人的第二副牙齒，共32顆。從6歲左右乳牙就開始逐漸脫落，恒牙開始萌出，取代乳牙。

脫落的乳牙中含有豐富的干細(xì)胞。有研究表明和其他成體干細(xì)胞相比，乳牙干細(xì)胞增殖更快，更幼稚，能夠分化為更多的組織細(xì)胞類型。因此，乳牙是理想的干細(xì)胞來源，可用于修復(fù)受損牙齒，誘導(dǎo)骨再生，還可用于治療神經(jīng)組織損傷或退行性疾病。

申請人在以前的研究中，通過酶消化法從乳牙中分離獲得具有克隆形成和高增殖能力的細(xì)胞。這些細(xì)胞在體外具有多向分化能力，包括成骨、成軟骨、成脂等。當(dāng)將這些細(xì)胞和羥基磷灰石/磷酸三鈣（HA/TCP）顆粒混合，移植于裸鼠皮下時，可形成牙本質(zhì)/牙髓樣結(jié)構(gòu)。

但這些細(xì)胞是高度異質(zhì)性的，是否像骨髓干細(xì)胞一樣存在嚴(yán)格的層級、譜系目前還不是很清楚。另外，因為缺乏特異的表面標(biāo)記，不利于細(xì)胞的體外分離和鑒定，也影響對其臨床功效的研究。

因此，通過特異的表面標(biāo)記提取特定的細(xì)胞亞群，不僅對細(xì)化研究這些細(xì)胞的生物學(xué)特性、了解乳牙干細(xì)胞的全貌至關(guān)重要，而且對不同細(xì)胞亞群是否有不同的臨床效果的研究也是非常關(guān)鍵的，有巨大的基礎(chǔ)研究和臨床意義。

所述的細(xì)胞表面標(biāo)記選自CD18，STRO-1，CD106/VCAM-1，CD146/MUC-18，HOP-26，CD49A/整合素β1，SB-10/CD166中的一個或多個。

CD18，也稱整合素β2亞家族，是細(xì)胞粘附分子中的一員，介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞間、細(xì)胞與基質(zhì)間的相互作用。由于CD18在白細(xì)胞上顯著表達(dá)，過去的很多研究都集中于CD18在白細(xì)胞粘附、遷移和免疫反應(yīng)中的作用。

但事實上，CD18也在骨髓基質(zhì)干細(xì)胞上表達(dá)，且在骨發(fā)生過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。缺乏CD18的小鼠表現(xiàn)出骨質(zhì)疏松癥的某些特征，包括骨密度降低，小梁骨數(shù)目減少，小梁骨厚度減少，骨小梁空間增加等。而通過病毒轉(zhuǎn)染，過表達(dá)CD18可促進(jìn)骨的形成。

申請人最近的研究證實，乳牙干細(xì)胞也表達(dá)CD18，而且CD18可作為一個獨特的細(xì)胞分選標(biāo)記，用于富集一種人乳牙干細(xì)胞亞群。

發(fā)明內(nèi)容

如上文所述，骨髓基質(zhì)干細(xì)胞也表達(dá)CD18。考慮到乳牙干細(xì)胞分化為功能性成牙本質(zhì)細(xì)胞（odontoblast）的路徑，和骨髓基質(zhì)干細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞的路徑相似。比如，骨形成過程中有效的調(diào)控因子，如TGFβ、BMP-2、和BMP-4被認(rèn)為啟動了成牙本質(zhì)細(xì)胞的發(fā)育。其它一些能夠影響成骨細(xì)胞的生長因子，包括bFGF、PDGF、EGF、IGF-1、TNFα、和IL-1β，也調(diào)控成牙本質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞的增殖和分化。再如，成牙本質(zhì)細(xì)胞和成骨細(xì)胞表達(dá)相似的礦化基質(zhì)蛋白，如牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白1、纖粘蛋白、I型膠原、堿性磷酸酶、骨結(jié)合素、骨橋蛋白、骨涎蛋白、骨鈣素等。我們創(chuàng)造性地發(fā)明了一種通過CD18特異性富集人乳牙干細(xì)胞亞群的方法，大大提高了體外乳牙干細(xì)胞分離和鑒定的效率。更為重要的是，通過該方法富集的乳牙干細(xì)胞亞群有更強(qiáng)的克隆形成能力，更優(yōu)的成骨分化能力，具有優(yōu)越的科研和臨床應(yīng)用前景。

具體地說，本發(fā)明是通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)的：

本發(fā)明提供了一種特異的人乳牙干細(xì)胞亞群的富集方法。本方法包含牙組織樣品的采集運(yùn)輸，乳牙干細(xì)胞的分離，及表達(dá)CD18乳牙干細(xì)胞的富集。