[發明專利]一種牙鲆胚胎肌衛星細胞系建立方法

有效

• 申請號: 201810595380.6
• 申請日: 2018-06-11
• 公開（公告）號: CN108753703B
• 公開（公告）日: 2022-03-04
• 發明（設計）人: 聶苗苗;譚訓剛;尤鋒;吳志昊;焦爽;肖鵬;婁雅楠;梁冬冬
• 申請（專利權）人: 中國科學院海洋研究所
• 主分類號: C12N5/077
• 分類號: C12N5/077
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標代理有限公司 21002
• 代理人: 李穎

本發明涉及海水魚類胚胎細胞培養技術，具體說是一種牙鲆胚胎期肌衛星細胞系的建立方法。將牙鲆克氏囊形成期的胚胎經過體外分離，去除卵膜，分散細胞，經原代培養和傳代培養，繼而建立胚胎期肌衛星細胞系。本發明建立的牙鲆胚胎肌衛星細胞系形態為梭形或者紡錘形單核細胞。單代內如培養超過5天或者進行外源因子(馬血清)誘導均能夠分化形成肌纖維。該細胞系能提供大量肌衛星細胞，經GFP轉染及半滑舌鰨脾腎壞死病毒攻毒實驗檢測，都可以正常轉染或被感染。故其不僅可以直接用于魚類肌肉生長發育相關功能基因的研究，為探索其肌肉細胞的誘導、增殖及分化的分子機制提供研究材料，而且為牙鲆育種中肌肉性狀的改良研究及應用提供平臺。

技術領域

本發明涉及海水魚類胚胎細胞培養技術，具體說是一種牙鲆胚胎期肌衛星細胞系的建立方法。

背景技術

動物細胞系及細胞培養已經成為生理學、免疫學、病毒學、發育生物學、基因功能以及毒理學等研究必不可少的工具和載體。魚類養殖業的不斷發展，需要對魚類生長發育、疾病爆發等及其機制開展研究，同時也提出了更前沿生物技術育種技術開發的需求，日益增長的海洋等水環境保護需求也延伸了有關魚類毒理研究的發展，而這些都將離不開魚類細胞系平臺，故其培養備受重視。自1962年第一個魚類細胞系建立起，越來越多的魚類細胞系建立成功并得到應用。胚胎的細胞有別于成體組織，其分化程度低，分裂能力強，多樣性高，其應用范圍更廣，故成為細胞培養的首選。而魚類胚胎細胞原代細胞培養多數采用飼養層細胞、添加魚類血清進行培養，以增加細胞生存能力。而魚類胚體期胚胎細胞系的建立尚未見到報道。有關肌肉肌衛星細胞系，已有報道也都是從幼魚或者成體肌肉組織分離的，如虹鱒(Jean et al.，2010)、牙鲆(Peng et al.，2016)，即從魚類胚胎中分離出肌衛星細胞未見到報道。我們首次從牙鲆胚體期胚胎中分離出肌衛星細胞，并進行體外培養，經過GFP轉染及病毒攻毒檢測，細胞均能正常轉染或感染，故將為研究牙鲆等魚類肌肉生長、相關性狀改良及毒理等研究提供平臺。

發明內容

本發明在于提供一種操作簡單、穩定的牙鲆胚胎期肌衛星細胞系的構建方法。

為實現上述目的，本發明采用技術方案為：

一種牙鲆胚胎肌衛星細胞系，將牙鲆克氏囊形成期的胚胎經過體外分離，去除卵膜，分散細胞，經原代培養和傳代培養，繼而建立胚胎期肌衛星細胞系。

經體視鏡下取發育到克氏囊形成期的受精卵，用滅菌海水清洗，再經含雙抗的PBS清洗，清洗后去除PBS，用滅菌研杵輕輕壓破胚胎外膜，使胚胎破膜而出，并輕輕垂直壓迫胚胎，使細胞盡量分離，分散后于DF12完全培養基中進行原代培養。

所述分散的細胞轉移到DF12完全培養基中培養，于25℃下正置培養，待細胞團完成貼壁后補加DF12完全培養基，實現原代培養。

待上述經原代培養的細胞團周圍細胞遷出并增殖鋪滿時，吸棄培養基，經PBS沖洗，加入0.25％的胰蛋白酶消化液消化；待細胞70％變圓，吸棄胰酶，終止消化后加入DF12完全培養基形成懸浮細胞液；而后利用細胞培養基按1:1-1:3(V/V)的比例分瓶傳代培養，之后根據細胞匯合度(80％以上)7-10天傳代一次，15代后每2-3天傳代一次；在25-30代后，通過稀釋法克隆培養，選擇優勢細胞逐漸分離出單一細胞并不斷地傳代，進而細胞系構建成功。

所述構建的細胞系能夠分化，并表達肌球蛋白。

所述通過稀釋法克隆培養，即以極低密度(10-10²個/mL)的細胞接種于多個T25細胞瓶中進行培養，選擇優勢細胞逐漸分離出單一形態的細胞并不斷地傳代，進而細胞系建立成功。

所述細胞培養基為在DF12培養基中加入占培養基總體積20％的胎牛血清，10ng/mL人堿性成纖維生長因子，15ng/mL表皮生長因子，100U/mL青霉素，100μg/mL鏈霉素，100μmol/L NEAA(非必需氨基酸)，27.5nmol/Lβ-巰基乙醇，2nmol/mL L-谷氨酰胺，pH值為7.2-7.4。