[發明專利]一種牙鲆胚胎肌衛星細胞系建立方法

有效

• 申請號: 201810595380.6
• 申請日: 2018-06-11
• 公開（公告）號: CN108753703B
• 公開（公告）日: 2022-03-04
• 發明（設計）人: 聶苗苗;譚訓剛;尤鋒;吳志昊;焦爽;肖鵬;婁雅楠;梁冬冬
• 申請（專利權）人: 中國科學院海洋研究所
• 主分類號: C12N5/077
• 分類號: C12N5/077
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標代理有限公司 21002
• 代理人: 李穎

1.一種牙鲆胚胎肌衛星細胞系，其特征在于：將牙鲆克氏囊形成期的胚胎經過體外分離，去除卵膜，分散細胞，經原代培養和傳代培養，繼而建立胚胎期肌衛星細胞系；

經體視鏡下取發育到克氏囊形成期的受精卵，用滅菌海水清洗，再經含雙抗的PBS清洗，清洗后去除PBS, 用滅菌研杵輕輕壓破胚胎外膜，使胚胎破膜而出，并輕輕垂直壓迫胚胎，使細胞盡量分離，細胞分散后于DF12 完全培養基中于25℃下正置培養，待細胞團完成貼壁后補加DF12 完全培養基，實現原代培養。

2.如權利要求1所述的牙鲆胚胎期肌衛星細胞系，其特征在于， 待上述經原代培養的細胞團周圍細胞遷出并增殖鋪滿時，吸棄培養基，經PBS沖洗，加入0.25%的胰蛋白酶消化液消化；待細胞70%變圓，吸棄胰酶，終止消化后加入DF12 完全培養基形成懸浮細胞液；而后利用細胞培養基按體積比1:1-1:3的比例分瓶傳代培養，之后根據細胞匯合度7-10天傳代一次，15代后每2-3天傳代一次；在25-30代后，通過稀釋法克隆培養，選擇優勢細胞逐漸分離出單一細胞并不斷地傳代，進而細胞系構建成功。

3.如權利要求2所述的牙鲆胚胎期肌衛星細胞系，其特征在于，所述構建的細胞系能夠分化形成肌纖維，并表達肌球蛋白。

4.如權利要求2所述的牙鲆胚胎期肌衛星細胞系，其特征在于，所述通過稀釋法克隆培養，即以10-10²個/mL的細胞接種于多個T25細胞瓶中進行培養，選擇優勢細胞逐漸分離出單一形態的細胞并不斷地傳代，進而細胞系建立成功。

5.如權利要求2所述的牙鲆胚胎期肌衛星細胞系，其特征在于，所述細胞培養基為在DF12培養基中加入占培養基總體積20%的胎牛血清，10 ng/mL 人堿性成纖維生長因子，15ng/mL表皮生長因子，100 U/mL青霉素，100 μg/mL鏈霉素，100 μmol/L NEAA，27.5 nmol/Lβ-巰基乙醇，2 nmol/mL L-谷氨酰胺，pH值為7.2-7.4。

6.如權利要求1所述的牙鲆胚胎期肌衛星細胞系，其特征在于，所述胚胎為海水或淡水魚類的相應胚胎。