[發(fā)明專利]一種通過細胞表面標記特異性富集的人牙周膜干細胞亞群及其干性檢測方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201810595335.0
• 申請日: 2018-06-11
• 公開（公告）號: CN108753702A
• 公開（公告）日: 2018-11-06
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 徐隨民
• 申請（專利權(quán)）人: 南京泰盛生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/077
• 分類號: C12N5/077;C12Q1/02;C12N15/867;A61L27/38;A61L27/54
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本發(fā)明提供了一種特異的人牙周膜干細胞亞群及其富集方法。本方法包含牙組織樣品的采集運輸，牙周膜干細胞的分離，及表達CD18干細胞的富集。本發(fā)明還提供了一種富集的牙周膜干細胞亞群生物學特性的檢測方法。包括與干性相關(guān)的集落形成能力檢測，增殖能力檢測，體外成骨分化能力檢測，體內(nèi)成骨分化能力檢測。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種通過細胞表面標記，優(yōu)選CD18特異性富集的人牙周膜干細胞亞群及其干性檢測方法。本發(fā)明也涉及將通過本發(fā)明富集的細胞用于再生醫(yī)學的用途。

背景技術(shù)

牙周膜是一種特殊的結(jié)締組織，連接牙骨質(zhì)和牙槽骨，對牙組織起支持營養(yǎng)作用，并維護牙組織的穩(wěn)態(tài)，修復受損牙組織。

牙周膜中包含異質(zhì)性的細胞群，可以分化為成牙骨質(zhì)細胞（Cementoblast），或成骨細胞（Osteoblasts）。

申請人在以前的研究中，通過酶消化法從牙周膜中分離獲得具有克隆形成和高增殖能力的細胞。這些細胞在體外具有多向分化能力，包括成骨、成軟骨、成脂等。當將這些細胞和羥基磷灰石/磷酸三鈣（HA/TCP）顆粒混合，移植于裸鼠皮下時，可形成牙骨質(zhì)/ 牙周膜樣組織。

但這些細胞是高度異質(zhì)性的，是否像骨髓干細胞一樣存在嚴格的層級、譜系目前還不是很清楚。另外，因為缺乏特異的表面標記，不利于細胞的體外分離和鑒定，也影響對其臨床功效的研究。

因此，通過特異的表面標記提取特定的細胞亞群，不僅對細化研究這些細胞的生物學特性、了解牙周膜干細胞的全貌至關(guān)重要，而且對不同細胞亞群是否有不同的臨床效果的研究也是非常關(guān)鍵的，有巨大的基礎(chǔ)研究和臨床意義。

所述的細胞表面標記選自CD18，STRO-1，CD106/VCAM-1，CD146/MUC-18，HOP-26，CD49A/整合素β1，SB-10/CD166中的一個或多個。

CD18，也稱整合素β2亞家族，是細胞粘附分子中的一員，介導細胞與細胞間、細胞與基質(zhì)間的相互作用。由于CD18在白細胞上顯著表達，過去的很多研究都集中于CD18在白細胞粘附、遷移和免疫反應中的作用。

但事實上，CD18也在骨髓基質(zhì)干細胞上表達，且在骨發(fā)生過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。缺乏CD18的小鼠表現(xiàn)出骨質(zhì)疏松癥的某些特征，包括骨密度降低，小梁骨數(shù)目減少，小梁骨厚度減少，骨小梁空間增加等。而通過病毒轉(zhuǎn)染，過表達CD18可促進骨的形成。

申請人最近的研究證實，牙周膜細胞也表達CD18，而且CD18可作為一個獨特的細胞分選標記，用于富集一種人牙周膜干細胞亞群。

發(fā)明內(nèi)容

如上文所述，骨髓基質(zhì)干細胞也表達CD18。而最近的研究發(fā)現(xiàn)，牙周膜細胞和成骨細胞有很多相似的特性，包括在體外形成礦物結(jié)節(jié)的能力，表達骨相關(guān)表面標記物堿性磷酸酶和骨涎蛋白，以及能夠響應骨誘導因子如甲狀旁腺激素、胰島素樣生長因子1、骨形態(tài)發(fā)生蛋白2、轉(zhuǎn)化生長因子β1等。基于這些事實，我們創(chuàng)造性地發(fā)明了一種通過CD18特異性富集人牙周膜干細胞亞群的方法，大大提高了體外牙周膜干細胞分離和鑒定的效率。更為重要的是，通過該方法富集的牙周膜干細胞亞群有更強的克隆形成能力，更優(yōu)的成骨分化能力，具有優(yōu)越的科研和臨床應用前景。

具體地說，本發(fā)明是通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)的：

本發(fā)明提供了一種特異的人牙周膜干細胞亞群的富集方法。本方法包含牙組織樣品的采集運輸，牙周膜干細胞的分離，及表達CD18細胞的富集。

本方法采用了含有多種抗生素組合的采集液收集牙組織樣品，包括但不限于青霉素、鏈霉素、二性霉素B等。該采集液也可用于其它組織樣品的采集，如脂肪、臍帶、胎盤等，可大大降低樣品污染的可能。