[發明專利]一種通過細胞表面標記特異性富集的人牙周膜干細胞亞群及其干性檢測方法

在審

• 申請號: 201810595335.0
• 申請日: 2018-06-11
• 公開（公告）號: CN108753702A
• 公開（公告）日: 2018-11-06
• 發明（設計）人: 徐隨民
• 申請（專利權）人: 南京泰盛生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/077
• 分類號: C12N5/077;C12Q1/02;C12N15/867;A61L27/38;A61L27/54
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1.一種通過細胞表面標記特異性富集的人牙周膜干細胞亞群，其特征在于，所述干細胞為人牙周膜干細胞，所述細胞表面標記選自CD18，STRO-1，CD106/VCAM-1，CD146/MUC-18，HOP-26，CD49A/整合素β1，SB-10/CD166中的一個或多個。

2.權利要求1所述的人牙周膜干細胞亞群，其特征在于，以CD18作為細胞表面標記，所述CD18使用熒光標記或磁珠標記。

3.一種權利要求1或2所述人牙周膜干細胞亞群的富集方法，其特征在于，所述方法的具體步驟如下：

步驟1，收集正常的成人拔除智齒，立即置于4℃預冷的含50-300U/mL青霉素、50-300μg/mL鏈霉素、和1-5μg/mL二性霉素B的α-MEM培養基中，2℃-8℃條件下運至潔凈實驗室，所述成人年齡為19到29歲，從收集到開始提取牙周膜干細胞的時間間隔不超過72小時；

步驟2，轉移至生物安全柜，取出智齒至培養皿，用4℃預冷的無菌磷酸鹽緩沖液清洗，即PBS清洗其外表面；

步驟3，從牙根表面輕輕剝離殘留的牙周膜組織；

步驟4，將牙周膜組織置于含1-10 mg/ml I型膠原酶和1-10 mg/ml分散酶的PBS中，37℃消化1小時；

步驟5，將消化液通過70微米的細胞篩過濾，獲得含有人牙周膜干細胞的單細胞懸液，900rpm離心5min，用PBS洗細胞一次；

步驟6，用PBS重懸細胞，加入CD18單抗，混勻，室溫避光孵育30分鐘；

步驟7，洗滌后，900rpm離心5min，用PBS重懸細胞；

步驟8，通過流式細胞儀分選或免疫磁珠分選，獲得CD18陽性干細胞亞群。

4.一種權利要求1或2所述人牙周膜干細胞亞群的干性檢測方法，其特征在于，所述方法的具體步驟如下：

步驟1，取富集的CD18陽性干細胞亞群，計數；

步驟2，900rpm 離心5min；

步驟3，用含10％-20% 胎牛血清、50μM-200μM的抗壞血酸2-磷酸酯、2mM谷氨酰胺、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的α-MEM培養基重懸細胞；

步驟4，將10⁴個CD18陽性干細胞接種于T25細胞培養瓶中，置于37℃、5％ CO₂的孵箱中培養；

步驟5，每3-4天換液，14-16天后，倒掉培養液，PBS清洗貼壁細胞，隨后用含有0.1%甲苯胺藍和2%多聚甲醛的PBS溶液進行固定、染色。

5.一種權利要求1或2所述人牙周膜干細胞亞群的干性檢測方法，其特征在于，所述方法的具體步驟如下：

步驟1，取富集的CD18陽性干細胞亞群，計數；

步驟2，900rpm 離心5min；

步驟3，用含10％-20% 胎牛血清、50μM-200μM的抗壞血酸2-磷酸酯、2mM谷氨酰胺、100U/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素的α-MEM培養基重懸細胞；

步驟4，將步驟3得到的細胞以10⁴每孔接種于12孔板中，置于37℃、5％ CO₂的孵箱中培養；

步驟5，培養1-2天后，加入Brdu試劑，所述Brdu試劑，孵育24h；

步驟6，Brdu染色試劑盒對細胞進行染色；蘇木素復染；鏡下計數陽性干細胞數，測定所述干細胞的增殖率。