[發(fā)明專利]一種檢測CVB3的熒光定量PCR引物、探針、試劑盒及方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810589858.4
• 申請日: 2018-06-08
• 公開（公告）號: CN108531661A
• 公開（公告）日: 2018-09-14
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 陸小梅;駱慶明;蔣再學(xué);王康偉;彭琪
• 申請（專利權(quán)）人: 東莞市第八人民醫(yī)院;東莞市兒科研究所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6851;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 東莞市華南專利商標事務(wù)所有限公司 44215
• 代理人: 姜華

本發(fā)明涉及生物檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種檢測CVB3的熒光定量PCR引物、探針、試劑盒及方法，所述引物的核苷酸序列為：B3?F：5’?ccattcaaggtccgagtca?3’、B3?R：5’?gcttgtcgtggtgttaatac?3’。所述探針的核苷酸序列為：B3：5’agagaacttcctatgtaggtcagc?3’，該試劑盒包括上述所述的引物和上述所述的探針。本發(fā)明的試劑盒利用熒光標記的探針與病毒靶序列特異性結(jié)合來指示擴增產(chǎn)物的有無，能檢測CVB3是否存在，還可以通過梯度標準品的對照計算病毒的拷貝數(shù)的大小，準確性好，靈敏度高。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種檢測CVB3的熒光定量PCR引物、探針、試劑盒及方法。

背景技術(shù)

病毒性心肌炎(viral myocarditis，VMC)是由病毒引起的心肌局限性或彌漫性的急性或慢性炎癥病變。近年來VMC在我國的發(fā)病呈上升趨勢，已成為兒童和青少年猝死的主要原因之一。部分患者呈自限性病程，重者可出現(xiàn)心力衰竭、心源性休克和猝死，部分患者可演變?yōu)閿U張型心肌病，致死率高達50％。腸道病毒屬的柯薩奇病毒A組、柯薩奇病毒B組、艾可病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒等為常見的致心肌炎病毒，其中柯薩奇病毒B組3型(CVB3)是最主要的病毒。目前對大部分病原無有效的疫苗及治療手段，研發(fā)相關(guān)早期診斷方法對VMC的防治具有重要意義。目前常用的病毒學(xué)實驗室診斷方法包括免疫學(xué)方法、病毒分離培養(yǎng)等方法，但都存在難以早期診斷、敏感度低等缺陷。熒光定量PCR技術(shù)方法，在核酸的水平上對病毒進行檢測，對人體內(nèi)所具有的相應(yīng)核酸可達到早期檢測的目的，為VMC的早期診斷提供了準確、快速、高效、敏感方法。

發(fā)明內(nèi)容

為了克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺點和不足，本發(fā)明的目的在于提供一種檢測CVB3的熒光定量PCR引物，該引物特異性好，檢測靈敏精確。

本發(fā)明的另一個目的在于提供一種檢測CVB3的熒光定量PCR探針，該探針特異性好，檢測靈敏精確。

本發(fā)明的還一個目的在于提供一種檢測CVB3的熒光定量PCR試劑盒，該試劑盒利用熒光標記的探針與病毒靶序列特異性結(jié)合來指示擴增產(chǎn)物的有無，能檢測CVB3是否存在，還可以通過梯度標準品的對照計算病毒的拷貝數(shù)的大小，準確性好，靈敏度高。

本發(fā)明的再一個目的在于提供一種檢測CVB3的熒光定量PCR方法，該方法具有準確、靈敏、窗口期短、效率高等優(yōu)點，操作相對簡便。

本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)：一種檢測CVB3的熒光定量PCR引物，所述引物的核苷酸序列如SEQ ID 1和SEQ ID 2所示，具體如下：

SEQ ID 1Coxsackievirus B3-F：5’-ccattcaaggtccgagtca-3’

SEQ ID 2Coxsackievirus B3-R：5’-gcttgtcgtggtgttaatac-3’。

所述引物的設(shè)計步驟如下：由于CVB3有較多的變異株，并且存在較多的SNP位點，為此我們選擇病毒株的保守結(jié)構(gòu)區(qū)間進行相關(guān)引物設(shè)計。根據(jù)分析，Rhv為CVB3基因組的保守結(jié)構(gòu)域，序列相對較為保守，可以保證引物設(shè)計針對CVB3的特異性。VP1蛋白是科薩奇特征蛋白，根據(jù)蛋白的位置，可知Coxsackievirus B3的VP1蛋白與其Rhv結(jié)構(gòu)域保守序列有重疊區(qū)域，因此可以從VP1上尋找保守區(qū)段設(shè)計引物。從NCBI下載Coxsackievirus B3的基因組全序列(GenBank：ID M33854.1)，VP1蛋白位置818-1101，VP1蛋白的序列如SEQ ID 5所示。通過SMART網(wǎng)站分析確定病毒的Rhv結(jié)構(gòu)域的蛋白位置為849-1017，經(jīng)過優(yōu)選，得到上述引物Coxsackievirus B3-F和Coxsackievirus B3-R。

在優(yōu)選引物條件下，所擴增出的目的片段如SEQ ID 3所示，具體為：