[發明專利]一種檢測CVB3的熒光定量PCR引物、探針、試劑盒及方法

在審

• 申請號: 201810589858.4
• 申請日: 2018-06-08
• 公開（公告）號: CN108531661A
• 公開（公告）日: 2018-09-14
• 發明（設計）人: 陸小梅;駱慶明;蔣再學;王康偉;彭琪
• 申請（專利權）人: 東莞市第八人民醫院;東莞市兒科研究所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6851;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 東莞市華南專利商標事務所有限公司 44215
• 代理人: 姜華

1.一種檢測CVB3的熒光定量PCR引物，其特征在于：所述引物的核苷酸序列為：

Coxsackievirus B3-F：5’-ccattcaaggtccgagtca-3’

Coxsackievirus B3-R：5’-gcttgtcgtggtgttaatac-3’。

2.一種檢測CVB3的熒光定量PCR探針，其特征在于：所述探針的核苷酸序列為：Coxsackievirus B3：5’agagaacttcctatgtaggtcagc-3’，所述探針的5’端標記熒光基團，3’標記淬滅基團。

3.根據權利要求2所述的一種檢測CVB3的熒光定量PCR探針，其特征在于：所述熒光基團為FAM，VIC，CY5或JOE中的一種。

4.根據權利要求2所述的一種檢測CVB3的熒光定量PCR探針，其特征在于：所述淬滅基團為BHQ，ECLIPSE中的一種。

5.一種檢測CVB3的熒光定量PCR試劑盒，其特征在于：所述試劑盒包括權利要求1所述的引物和權利要求2-4任一項所述的探針。

6.一種用于非治療目的的檢測CVB3的熒光定量PCR方法，其特征在于：包括如下步驟：

(1)提取樣本RNA：采用磁珠法提取樣本RNA；

(2)反應液配置：將待測樣品的病毒RNA、同樣量的陰性標準品和系列稀釋的陽性標準品分別配制成PCR反應液；

(3)熒光定量PCR：將上述PCR反應液進行PCR擴增，通過比較待測樣品和相應標準品的Ct值，對待測樣品的起始拷貝數進行定量。

7.根據權利要求5所述的一種檢測CVB3的熒光定量PCR方法，其特征在于：所述步驟(1)具體為：

(1.1)樣本處理：將樣品在超凈工作臺轉入無酶EP管中，加入1mL裂解液，并旋渦振蕩至無明顯顆粒物，室溫靜止4-6min；

(1.2)分離RNA層：向EP管中加入180-220μL氯仿，蓋緊EP管蓋，振蕩混合溶液至乳濁液，室溫靜止4-6min，然后在3-5℃溫度下以10000-14000g離心力離心8-12min，從離心機中取出EP管，內部勻漿液分為三層，小心吸取最上層無色溶液并轉移到新的EP管中；

(1.3)核酸結合：向EP管中加入350-450μL異丙醇和15-25μL提前搖晃均勻的磁珠懸浮液，高速旋渦振蕩4-6min；

(1.4)磁性分離：將EP管置于磁力架上靜置15-25s至磁珠吸附完全，如EP管中有磁珠殘液，可保持EP管在磁力架上，整體上下顛倒2-3次使磁珠吸附完全；去上清液。

(1.5)一次清洗：向EP管中加入500-700μL清洗液A，用移液槍吹散磁珠，旋渦振蕩1.5-2.5min，參照步驟(1.4)進行磁性分離；

(1.6)二次清洗：使用500-700μL清洗液B，參照步驟(1.5)操作兩次；

(1.7)洗脫：將棄盡上清液的EP管保持于磁力架上，打開EP管室溫晾干6-10min至無明顯乙醇味；向EP管中加入30-100μL洗脫液，旋渦振蕩至磁珠全部分散于液相中，56-60℃水浴4-6min；洗脫完畢，用移液槍將洗脫液轉移至另一干凈EP管中；將所提取的RNA反應液置于超低溫冰箱待用。