[發(fā)明專利]檢測大腸埃希氏菌O157的RPA引物、探針、試劑盒和方法

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• 申請日: 2018-06-08
• 公開（公告）號: CN108728559A
• 公開（公告）日: 2018-11-02
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 蘭全學(xué);嚴(yán)瓊英;楊平;陳佳平;王遠(yuǎn)洋;王曉雯;劉靈燕;楊國武;盛司潼;孫文龍
• 申請（專利權(quán)）人: 深圳市計量質(zhì)量檢測研究院（國家高新技術(shù)計量站;國家數(shù)字電子產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心）;深圳華因康基因科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6844;C12N15/11
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發(fā)明提供檢測大腸埃希氏菌O157的RPA引物、探針、試劑盒和方法。本發(fā)明檢測大腸埃希氏菌O157的RPA引物包括針對rfbE基因的上游引物Seq ID No.1和下游引物Seq ID No.2。相對于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的試劑盒及檢測方法，可快速檢測樣品中是否存在大腸埃希氏菌O157核酸。操作簡單，無需特殊昂貴的儀器，在疾病監(jiān)測、臨床診斷和食品安全監(jiān)測等領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用價值。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及檢測大腸埃希氏菌O157的RPA引物和探針、試劑盒及RPA等溫快速檢測方法。

背景技術(shù)

大腸埃希氏菌O157是腸出血性大腸埃希氏菌主要的血清型，它可以導(dǎo)致病人出現(xiàn)腹瀉、出血性腸炎及相關(guān)的病發(fā)癥，嚴(yán)重的會危及病人生命。該病菌曾多次在國外和我國爆發(fā)、流行，給全球的經(jīng)濟(jì)帶來了巨大的損失，目前它已成為了世衛(wèi)組織關(guān)注的一個熱點(diǎn)問題。因此，開發(fā)大腸埃希氏菌O157的快速檢測方法對該菌的預(yù)防和檢測非常重要。

目前大腸埃希氏菌O157的檢測方法主要是分離培養(yǎng)法和PCR方法。分離培養(yǎng)法無需昂貴的設(shè)備，成本較低，但是該方法對人員要求較高并且檢測周期較長，無法實現(xiàn)對樣品的快速檢測?；诜肿由飳W(xué)原理的PCR方法也被大量應(yīng)用到了大腸埃希氏菌O157的檢測之中，該檢測方法由于需要配套較昂貴的設(shè)備因而也不利于在基層單位中的推廣也不利于現(xiàn)場快速檢測。因此為確保食品安全的快速發(fā)展，急需有關(guān)大腸埃希氏菌O157的快速檢測方法。

重組酶聚合酶等溫擴(kuò)增技術(shù)( recombinase polymerase amplification, RPA)是2006年由英國研究人員研發(fā)的一種新型的等溫擴(kuò)增技術(shù)，其原理是在恒溫下，重組酶與寡核苷酸引物形成復(fù)合體，酶促使引物定位到DNA雙鏈模板的同源靶序列上，解鏈模板DNA，引物與模板單鏈結(jié)合并在DNA聚合酶的作用下，形成新的DNA互補(bǔ)鏈，同時單鏈DNA結(jié)合蛋白與另外一條模板單鏈結(jié)合。該方法的主要特點(diǎn)在等溫條件下即可高效、快速、高特異、高靈敏的擴(kuò)增靶基因。目前RPA技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用到病毒、細(xì)菌、支原體、寄生蟲等的快速檢測中，然而目前并沒有基于大腸埃希氏菌O157 rfbE基因的引物和探針及檢測方法被應(yīng)用于大腸埃希氏菌O157的檢測中。

目前多種大腸埃希氏菌O157的毒力基因和染色體上的基因被當(dāng)作靶基因應(yīng)用于大腸埃希氏菌O157的檢測中，但是這些靶基因特異性并不理想。大腸埃希氏菌O157 rfbE基因是與O157脂多糖抗原編碼相關(guān)的基因，有文獻(xiàn)報導(dǎo)針對該基因建立的PCR法可以特異檢測出大腸埃希氏菌O157，并且該方法對其他O血清型大腸埃希氏菌和腸道微生物的檢測結(jié)果全都為陰性。因此基于大腸埃希氏菌O157 rfbE基因的RPA引物和探針及RPA檢測方法在對大腸埃希氏菌O157的檢測中將有著優(yōu)良的特異性。

發(fā)明內(nèi)容

為了解決以上技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種方便快速的檢測大腸埃希氏菌O157的RPA引物、探針、試劑盒和方法。

一種檢測大腸埃希氏菌O157的RPA引物，針對rfbE 基因包括

上游引物Seq ID No.1: 5’-AAAGGTAAATATGTGGGTTGATAACGACTA-3’和下游引物Seq IDNo.2：5’-AAAATCATCAGCTTGTTCATTCACCCGATA-3’。

一種檢測大腸埃希氏菌O157的RPA引物，采用所述的引物中的上游引物、下游引物中的至少一種，或選自所述的引物中的上游引物、下游引物序列或上游引物、下游引物序列的互補(bǔ)鏈序列中單條序列同源性為50%及以上的堿基序列。