[發明專利]檢測大腸埃希氏菌O157的RPA引物、探針、試劑盒和方法

在審

• 申請號: 201810585976.8
• 申請日: 2018-06-08
• 公開（公告）號: CN108728559A
• 公開（公告）日: 2018-11-02
• 發明（設計）人: 蘭全學;嚴瓊英;楊平;陳佳平;王遠洋;王曉雯;劉靈燕;楊國武;盛司潼;孫文龍
• 申請（專利權）人: 深圳市計量質量檢測研究院（國家高新技術計量站;國家數字電子產品質量監督檢驗中心）;深圳華因康基因科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6844;C12N15/11
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1. 一種檢測大腸埃希氏菌O157的RPA引物，其特征在于，針對rfbE 基因包括

上游引物Seq ID No.1: 5’-AAAGGTAAATATGTGGGTTGATAACGACTA-3’和下游引物Seq IDNo.2：5’-AAAATCATCAGCTTGTTCATTCACCCGATA-3’。

2. 一種檢測大腸埃希氏菌O157的RPA引物，其特征在于，采用權利要求1所述的引物中的上游引物、下游引物中的至少一種，或選自權利要求1所述的引物中的上游引物、下游引物序列或上游引物、下游引物序列的互補鏈序列中單條序列同源性為50%及以上的堿基序列。

3.一種檢測大腸埃希氏菌O157的RPA探針，其特征在于，針對rfbE基因，其包括探針序列Seq ID No.3：5’- TGGAATGGTTGTCACGAATGACAAAAGTGTACTAGAGGCTTCAAAAC -3’

所述探針序列Seq ID No.3的5’端32bp 的位置處采用dSpacer 修飾，dSpacer分子兩側的胸腺嘧啶分別被熒光基團和淬滅基團取代，所述探針序列Seq ID No.3的3’末端通過阻塞基團C3Spacer或磷酸化進行修飾。

4.如權利要求3所述的檢測大腸埃希氏菌O157的RPA探針，其特征在于，所述熒光基因采用FAM-dT熒光標記基團，所述淬滅基團采用BHQ1-dT熒光標記基團。

5.一種檢測大腸埃希氏菌O157的RPA探針，其特征在于，采用權利要求3所述的探針序列或其互補鏈序列中單條序列同源性為50%及以上的堿基序列。

6.一種檢測大腸埃希氏菌O157的RPA試劑盒，其特征在于，包括含有如權利要求1所述的引物和如權利要求3或5所述的探針以凍干粉形式的RPA反應組分、RPA反應緩沖液。

7.一種檢測大腸埃希氏菌O157的RPA方法，其特征在于，包括如下步驟：

（1）提取待測樣品基因組DNA；

（2）采用權利要求6所述的試劑盒、步驟(1)提取的待測樣品基因組DNA以及醋酸鎂，配制成RPA反應體系；

（3）將步驟（2）配置的反應體系在恒溫下進行擴增反應，整個反應過程收集熒光信號；

（4）根據擴增反應結果確定待測樣品基因組DNA中是否含有大腸埃希氏菌O157。