[發(fā)明專利]一種病毒原液的制備方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810584021.0
• 申請(qǐng)日: 2018-06-08
• 公開（公告）號(hào): CN108841794B
• 公開（公告）日: 2021-11-30
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 汪濤
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 蘇州良辰生物醫(yī)藥科技有限公司
• 主分類號(hào): C12N7/00
• 分類號(hào): C12N7/00;C12R1/93
• 代理公司: 蘇州創(chuàng)元專利商標(biāo)事務(wù)所有限公司 32103
• 代理人: 汪青;周敏

本發(fā)明涉及一種病毒原液的制備方法，將宿主細(xì)胞采用無血清培養(yǎng)基進(jìn)行清洗；將葡聚糖、磷酸鹽緩沖液和病毒配制成混合液；將混合液加入到經(jīng)處理后的宿主細(xì)胞中進(jìn)行吸附感染；將經(jīng)處理后的宿主細(xì)胞用含有胎牛血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)；將經(jīng)處理后的宿主細(xì)胞進(jìn)行凍融使病毒釋放，然后經(jīng)離心得到病毒原液。本發(fā)明通過采用葡聚糖代替聚凝胺，由于葡聚糖本身是一種陽(yáng)離子多聚合物，它與帶負(fù)電荷的病毒結(jié)合后接近細(xì)胞膜而被攝取，而對(duì)細(xì)胞本身沒有毒性作用，從根本上可以提高宿主細(xì)胞的生長(zhǎng)率及增殖效率，對(duì)病毒的擴(kuò)增起到明顯的促進(jìn)作用，從而使得制得的病毒原液的病毒滴度高。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種病毒原液的制備方法。

背景技術(shù)

病毒原液可用于制備疫苗，也可以在病毒滅活驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中作為指示病毒添加，而作為指示病毒用于病毒滅活驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中時(shí)，病毒原液的病毒滴度越大，則所需添加的病毒原液越少，從而能夠降低病毒滅活驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的成本。

現(xiàn)有技術(shù)中，異嗜性小鼠白血病病毒原液通常是將含有異嗜性小鼠白血病病毒的溶液接種于宿主細(xì)胞中，進(jìn)行共培養(yǎng)，在培養(yǎng)液中需要加入聚凝胺來提高異嗜性小鼠白血病病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞的感染效率（聚凝胺主要作用是提高逆轉(zhuǎn)錄病毒感染細(xì)胞的效率，作用原理可能是通過中和細(xì)胞表面唾液酸與病毒顆粒之間的靜電排除從而促進(jìn)吸附作用），進(jìn)而提高異嗜性小鼠白血病病毒的滴度。

但是，在聚凝胺的使用過程中，聚凝胺在促進(jìn)異嗜性小鼠白血病病毒進(jìn)入細(xì)胞進(jìn)行復(fù)制過程中對(duì)宿主細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用，使得宿主細(xì)胞本身的增殖效率不高，從而影響異嗜性小鼠白血病病毒的感染程度導(dǎo)致擴(kuò)增的病毒滴度較低。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種病毒滴度高的病毒原液的制備方法。

為解決以上技術(shù)問題，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種病毒原液的制備方法，包括如下步驟：

（1）、將宿主細(xì)胞用無血清培養(yǎng)基進(jìn)行清洗；

（2）、將葡聚糖、磷酸鹽緩沖液和病毒配制成混合液，其中，所述的混合液中葡聚糖的濃度為15~30μg/mL，所述的病毒的體積百分濃度為0.005%～0.1%；

（3）、將步驟（2）制得的所述的混合液加入到經(jīng)步驟（1）處理后的宿主細(xì)胞中進(jìn)行吸附感染；

（4）、將經(jīng)步驟（3）處理后的宿主細(xì)胞用含有胎牛血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)；

（5）、將經(jīng)步驟（4）處理后的宿主細(xì)胞進(jìn)行凍融使病毒釋放，然后經(jīng)離心得到所述的病毒原液。

本發(fā)明中，消化傳代的方法采用常規(guī)方法即可。

優(yōu)選地，步驟（1）中所述的宿主細(xì)胞由種子細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)得到。

優(yōu)選地，待培養(yǎng)皿表面80%以上的面積長(zhǎng)有所述的宿主細(xì)胞后進(jìn)行清洗。

本發(fā)明中，所述的宿主細(xì)胞可以通過購(gòu)買得到的種子細(xì)胞，采用培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)得到；為了避免每次購(gòu)買種子細(xì)胞的麻煩，也為了降低成本，也可以通過購(gòu)買得到的種子細(xì)胞，采用培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)得到細(xì)胞株進(jìn)行建庫(kù)，然后從庫(kù)中取出細(xì)胞株采用培養(yǎng)基進(jìn)一步培養(yǎng)得到宿主細(xì)胞。

優(yōu)選地，所述的宿主細(xì)胞為CHO細(xì)胞。

優(yōu)選地，所述的病毒為異嗜性小鼠白血病病毒。

優(yōu)選地，步驟（3）中，所述的混合液的投料體積與所述的培養(yǎng)皿的表面面積的比為0.015~0.055 mL /cm²。

優(yōu)選地，步驟（3）中進(jìn)行所述的吸附感染時(shí)，通過震蕩使所述的病毒與所述的宿主細(xì)胞接觸。

優(yōu)選地，步驟（3）中，控制所述的吸附感染的時(shí)間為2~4小時(shí)。