[發明專利]一種牦牛源輪狀病毒重組VP6蛋白抗原與應用

在審

• 申請號: 201810582665.6
• 申請日: 2018-06-07
• 公開（公告）號: CN108690126A
• 公開（公告）日: 2018-10-23
• 發明（設計）人: 湯承;岳華;羅雪;王遠微
• 申請（專利權）人: 西南民族大學
• 主分類號: C07K14/14
• 分類號: C07K14/14;C12N15/70;C12N15/46;G01N33/68;G01N33/543;A61K39/15;A61P31/14;A61P1/12
• 代理公司: 成都天匯致遠知識產權代理事務所(普通合伙) 51264
• 代理人: 韓曉銀

1.一種牦牛源輪狀病毒重組VP6蛋白抗原，其特征在于，牦牛源輪狀病毒重組VP6蛋白抗原由重組載體質粒pET-28H-VP6質粒轉化Rosetta(DE3)菌株中表達；其中重組載體質粒pET-28H-VP6含有牦牛源輪狀病毒VP6基因。

2.根據權利要求1所述的牦牛源輪狀病毒重組VP6蛋白抗原，其特征在于，所述抗原的核苷酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示，所述抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

3.根據權利要求1所述的牦牛源輪狀病毒重組VP6蛋白抗原，其特征在于，所述的牦牛源輪狀病毒重組VP6蛋白通過以下方法制備得到：提取病毒核酸后進行RT-PCR，拼接擴增序列，得到序列表中SEQ ID NO.1的DNA序列；對該基因序列進行優化，5’增加酶切位點BamHI，3’增加酶切位點Xho I，His標簽在N端，然后合成整個序列；將合成的全序列與pET-28H載體分別酶切后連接轉化TOP10感受態，獲得pET-28H-VP6質粒；將所得到的重組原核表達載體pET-28H-VP6轉化大腸桿菌Rosetta(DE3)感受態細胞，用終濃度為0.8mM的IPTG于37℃誘導重組VP6蛋白的表達16h，將所表達的蛋白回收并純化即得。

4.根據權利要求3所述的牦牛源輪狀病毒重組VP6蛋白抗原，其特征在于，PCR反應的拼接引物共2條引物：兩端酶切位點分別是BamH1和Xho1，其序列分別如SEQ ID NO.4-SEQ IDNO.5所示。

5.一種基于牦牛源輪狀病毒重組VP6蛋白的間接ELISA檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：0.1μg權利要求1-4中任一權利要求所述的牦牛源輪狀病毒重組VP6蛋白包被酶標板，37℃孵育2h；PBST洗滌后加入4％PEG6000封閉30min；PBST洗滌后加入1:1400稀釋的血清，37℃孵育2h；PBST洗滌后加入1:2300稀釋的酶標二抗，37℃孵育30min；PBST洗滌后加入顯色液，37℃避光顯色10min，加入終止液在450nm處讀取OD₄₅₀。

6.根據權利要求5所述的間接ELISA檢測方法，其特征在于，所述牦牛源輪狀病毒重組VP6蛋白的包被濃度為1μg/ml。

7.根據權利要求5所述的間接ELISA檢測方法，其特征在于，血清稀釋濃度為1:1400，酶標二抗稀釋濃度為1:2300。

8.一種利用權利要求1所述的牦牛源輪狀病毒重組VP6蛋白生產的亞單位疫苗。

9.根據權利要求8所述的亞單位疫苗，其特征在于，用權利要求1所述的牦牛源輪狀病毒重組VP6蛋白作為抗原，粘膜佐劑作為佐劑，以滴鼻的方式免疫BALB/c成年雌鼠，刺激母鼠體內產生了高水平的血清IgG抗體；用牛輪狀病毒同時對免疫母鼠所生乳鼠和未免疫母鼠所生乳鼠灌胃攻毒，證實母源抗體傳遞給乳鼠，免疫母鼠為乳鼠提供保護。

10.權利要求9所述的牦牛源輪狀病毒重組VP6蛋白生產的亞單位疫苗在預防輪狀病毒引起的幼齡動物腹瀉中的應用。