[發(fā)明專利]一種特異性檢測煙曲霉的引物探針組合和基于熒光PCR法檢測煙曲霉的試劑盒

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810582569.1
• 申請日: 2018-06-07
• 公開（公告）號: CN108707691A
• 公開（公告）日: 2018-10-26
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 方園;任云;歐陽云
• 申請（專利權(quán)）人: 杭州締藍(lán)生物技術(shù)有限公司
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/68
• 代理公司: 北京高沃律師事務(wù)所 11569
• 代理人: 劉奇

本發(fā)明提供了一種特異性檢測煙曲霉的引物探針組合和一種基于熒光定量PCR檢測煙曲霉的試劑盒，屬于病原微生物體外分子檢測技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明提供了一種特異性檢測煙曲霉的引物探針組合，所述引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述探針的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。本發(fā)明提供的包含引物探針組合的熒光定量PCR試劑盒能夠?qū)崿F(xiàn)煙曲霉的特異性檢測，具有檢測特異型強(qiáng)、靈敏度高的特點。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及病原微生物體外分子檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種特異性檢測煙曲霉的引物探針組合和基于熒光PCR法檢測煙曲霉的試劑盒。

背景技術(shù)

深部真菌病是指致病真菌不僅侵犯皮膚、黏膜而且侵犯深部組織和內(nèi)臟所致的疾病。真菌廣泛分布于自然界，某些真菌可以感染人體而致病。深部真菌病常為繼發(fā)感染，多在糖尿病、血液病、惡性腫瘤、大面積燒傷、嚴(yán)重營養(yǎng)不良或其他慢性消耗性疾病的基礎(chǔ)上發(fā)病。或長期應(yīng)用抗生素、糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑、使機(jī)體內(nèi)菌群失調(diào)或抑制了機(jī)體的免疫反應(yīng)而誘發(fā)。

曲霉屬于條件致病菌，廣泛存在于生活環(huán)境中，其分生孢子微小，可隨呼吸進(jìn)入機(jī)體，以纖維蛋白、層連蛋白、血纖維蛋白原等為中介，黏附于宿主組織細(xì)胞，萌發(fā)菌絲，進(jìn)而致病。曲霉菌病是由致病曲霉菌所引起的疾病。致病曲霉菌主要經(jīng)呼吸道侵犯肺部，也可侵犯皮膚、黏膜。嚴(yán)重者可發(fā)生敗血癥，使其他組織和系統(tǒng)受累。常見的病原菌有煙曲霉、黃曲霉、黑曲霉等，其中煙曲霉是最常見的病原菌，當(dāng)免疫功能受抑制或損傷時易受感染。

目前實驗室對于曲霉的檢測主要有以下四種：

(1)病原體培養(yǎng)鑒定檢測法

取自患處的標(biāo)本作直接涂片或培養(yǎng)，涂片可見菌絲或曲霉菌孢子，培養(yǎng)見曲霉菌生長。曲霉菌是實驗室常見的污染菌，必須反復(fù)涂片或培養(yǎng)，多次陽性且為同一菌種才有診斷價值。雖然培養(yǎng)鑒定法是臨床最常采用的方法，但是其培養(yǎng)周期較長。

(2)病理組織檢查

取受損組織或淋巴結(jié)活檢，可根據(jù)真菌形態(tài)確診。尤其對播散性曲霉菌，可及時作出診斷。病理組織檢查的結(jié)果較為可靠，但是由于其具有創(chuàng)性，多數(shù)患者難以接受，限制了其應(yīng)用。

(3)免疫學(xué)檢測法

檢測血清中煙曲霉IgM和IgG抗體的酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)，曲霉菌抗原檢測方法主要有1,3-β-D葡聚糖檢測(G試驗)和半乳甘露聚糖檢測(GM試驗)。1,3-β-D葡聚糖抗原是除結(jié)核菌和隱球菌外所有真菌特有的一種細(xì)胞壁成分，以血清為檢測樣本，G試驗不能夠區(qū)分念珠菌屬和曲霉菌屬，也不能鑒定菌種，更不能鑒定是否煙曲霉。半乳甘露聚糖是存在于曲霉菌細(xì)胞壁中的一類具有高度特異性和高度保守型的多糖，可作為曲霉菌檢測的特異性分子標(biāo)志物，酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)是較為常見的半乳甘露聚糖抗原檢測方法，但GM試驗靈敏度不高，不能夠區(qū)分不同的菌種，因此不能鑒定是否煙曲霉感染，而且常常發(fā)生假陽性或假陰性。

(4)實時熒光聚合酶鏈反應(yīng)法(Real-Time Fluorescence Polymerase ChainReaction，熒光PCR)