[發明專利]基于Taqman探針的腎小管上皮細胞特異性基因檢測熒光定量PCR一步法試劑盒

有效

• 申請號: 201810580404.0
• 申請日: 2018-06-07
• 公開（公告）號: CN108728528B
• 公開（公告）日: 2021-08-24
• 發明（設計）人: 劉必成;周樂汀;雷向東
• 申請（專利權）人: 東南大學;上海境象生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6883
• 分類號: C12Q1/6883
• 代理公司: 南京蘇高專利商標事務所(普通合伙) 32204
• 代理人: 孫斌

本發明公開了一種基于Taqman探針的腎小管上皮細胞特異性基因檢測熒光定量PCR一步法試劑盒及其應用，該試劑盒包括檢測腎小管上皮細胞特異性基因BBOX1以及內參基因B2M的上下游引物及探針。本發明熒光定量PCR試劑盒具有取材量小、操作簡便且檢測周期短的優點，能夠用于檢測尿液、組織中BBOX1基因表達水平的快速檢測。同時在檢測過程中mRNA逆轉錄及熒光定量一步完成，均在單管中進行，勿需打開管蓋，熒光信號的產生不僅強烈依賴于靶模板同探針的雜交，而且同時強烈依賴于靶模板的擴增，故不存在非特異性擴增現象。從而可快速、特異、靈敏地檢測BBOX1基因的mRNA表達水平。

技術領域

本發明涉及生物醫學領域，具體涉及一種基于Taqman探針的腎小管上皮細胞特異性基因檢測熒光定量PCR一步法試劑盒。

背景技術

腎小管上皮細胞(renal tubular epithelial cell,RTEC)為被覆于腎小管內側的上皮細胞，由中胚層后腎間充質細胞在胚胎第5周轉分化而來。正常RTEC代謝活性旺盛，具有重吸收和排泌等多種生理功能。既往研究認為腎小球炎癥和硬化是腎臟疾病進展的主要推動者,而腎小管病變僅僅是腎小球病變的受累者,其本身在疾病進展中的作用并不突出。然而，近年來大量研究證據表明,在多種損傷因素刺激下(缺氧、中毒、細胞炎癥因子、血漿蛋白或葡萄糖等)，RTEC可發生一系列損傷、活化及表型轉化等改變，并釋放多種炎癥因子和生長因子，促進腎臟疾病的發生發展。不僅如此，腎小管間質病變程度與腎功能下降嚴重程度和疾病預后密切相關。因此，目前認為RTEC損傷是腎臟疾病的核心病理生理環節之一。

RTEC受到損傷后可脫落入尿液，導致尿液中RTEC計數顯著增加，并可作為多種腎臟疾病的生物標志物。然而，由于形態學上的相似性，RTEC與來自于下尿路的上皮細胞極難鑒別。信使核糖核酸(mRNA)由DNA的一條鏈作為模板轉錄而來的、能指導蛋白質合成的一類單鏈核糖核酸。我們最近的研究發現，在眾多尿路細胞中，RTEC特異性表達BBOX1 mRNA。檢測尿液中相應mRNA水平對提示腎小管損傷以及腎臟疾病的診斷、預后監測具有獨特價值。

基于Taqman探針的熒光定量PCR技術通過Taqman探針與模板的特異性雜交來鑒別模板，具有很高的準確性，假陽性率低，特異性好。

發明目的

發明內容：針對現有技術存在的問題，本發明提供一種基于Taqman探針的腎小管上皮細胞特異性基因檢測熒光定量PCR一步法試劑盒。該熒光定量PCR試劑盒具有取材量小、操作簡便且檢測周期短的優點，能夠用于尿液、組織中BBOX1基因表達水平的快速檢測。

本發明還提供該基于Taqman探針的腎小管上皮細胞特異性基因檢測熒光定量PCR試劑盒的應用。

技術方案：為了實現上述目的，如本發明所述一種基于Taqman探針的腎小管上皮細胞特異性基因檢測熒光定量PCR一步法試劑盒，包括檢測BBOX1基因的上下游引物及探針，其核苷酸序列如SEQ ID NO 1-3所示；檢測B2M內參基因的上下游引物及探針，其核苷酸序列如SEQ ID NO 4-6所示。

其中，所述PCR試劑盒還包括PCR酶混合液和MasterMix。

所述PCR酶混合液為m-mlv逆轉錄酶和RNase inhibitor混合液。其中，m-mlv逆轉錄酶濃度為1000U/ul，RNase inhibitor濃度為600U/ul。

所述MasterMix包含濃度為100mM的KCl，濃度為6mM的MgCl₂，濃度為80mM、pH為8.0的Tris-HCl，濃度為0.6mM的dNTPs，濃度為0.06U/ul的熱啟動Taq酶，以及0.2M的PCR增強劑。

其中，所述BBOX1和B2M基因的探針連接的熒光基團為：FAM-BHQ 1。

進一步地，所述探針5’端標記的熒光報告基團是FAM，3’端連接淬滅基團。