[發明專利]酶活性和耐熱性提高的β-甘露聚糖酶突變體及其編碼基因和應用

有效

• 申請號: 201810578897.4
• 申請日: 2018-06-07
• 公開（公告）號: CN110577946B
• 公開（公告）日: 2021-01-26
• 發明（設計）人: 肖志壯;張穩;薛海曌;方安然
• 申請（專利權）人: 青島紅櫻桃生物技術有限公司
• 主分類號: C12N9/42
• 分類號: C12N9/42;C12N15/56;C12N15/81;A23K20/189;A23K50/30;A23K50/75;A23K50/80
• 代理公司: 青島合創知識產權代理事務所(普通合伙) 37264
• 代理人: 王曉曉

本發明提供了酶活性和耐熱性提高的β?甘露聚糖酶突變體及其編碼基因和應用。本發明通過對原始基因來源于黑曲霉的β?甘露聚糖酶突變體使用易錯PCR方法對β?甘露聚糖酶糖酶MAN?1基因進行進一步改造，再使用高通量篩選方法挑選出正突變，經過一輪易錯PCR，最終獲得4個酶活顯著提高的新的突變體，本發明獲得的β?甘露聚糖酶糖酶突變體與原始基因相比，突變體的酶活性和耐熱性得到顯著提高，有利于實現其在商業中的應用，從而降低生產成本。

技術領域

本發明屬于基因工程和酶工程技術領域，具體涉及酶活性和耐熱性提高的β-甘露聚糖酶突變體及其編碼基因和應用。

背景技術

β-甘露聚糖酶作為一種酶制劑，近年來已在飼料、食品、醫藥等領域得到了廣泛的應用。β-甘露聚糖酶(β-l，4-D-mannan mannohy-drolase,EC3.2.1.78)是一類能水解含β-1,4-D-甘露糖苷鍵的甘露聚糖(包括均一甘露聚糖、葡萄甘露聚糖和半乳甘露聚糖)的半纖維素酶，具有一般非淀粉多糖(NSP)酶類的作用——降解NSP，降低腸道粘度，促進營養物質的消化和吸收外，還可以促進類胰島素生長因子(IGF—I)的分泌，促進蛋白質的合成，提高瘦肉率；同時，它還可消除豆類中富含的β-甘露聚糖對葡萄糖吸收的干擾，極大提高餅粕尤其是豆餅的能量消化率。由于動物攝食、營養和飼料加工過程的特殊需求，提高酸性β-甘露聚糖酶的溫度耐受性具有非常重要的意義。

酶分子定向進化是定向改造酶結構和功能的新型策略和有效的技術手段。它模擬酶自然進化的過程，利用基因工程各種技術手段，以較低的比率向目的基因中隨機引入突變或將目的基因進行重組，從而獲得突變體文庫，再借助一定的篩選方法，選出所需特性得到優化的酶。定向進化的目的在于人為地對天然酶的某些性質加以改變，以便能增強其在工業生產環境中的穩定性，創造天然酶所不具備的某些優良特性，甚至創造出新的活性，產生新的催化能力，從而擴大酶作為生物催化劑在工業生產中的應用范圍。該技術的優勢在于不需要深入了解目標蛋白的結構信息，可簡單快速實現對目標蛋白的定向進化。

易錯PCR(epPCR)是基于大幅增加DNA Taq聚合酶總體錯配頻率的一種常用定向進化方法。該法主要是利用提高DNA聚合酶突變頻率，在PCR過程中向目的基因中以一定頻率引入突變從而獲得突變體。

發明內容

本發明的目的是提供了酶活性和耐熱性提高的β-甘露聚糖酶突變體及其編碼基因和應用。本發明通過隨機突變β-甘露聚糖酶氨基酸序列來提高其酶活性，本發明的另一目的是提供了包含上述突變得到的β-甘露聚糖酶基因的重組載體。將突變得到的β-甘露聚糖酶基因插入到表達載體合適的限制性酶切位點之間，使其核苷酸序列可操作的與表達調控序列相連接，得到重組酵母表達質粒。本發明還提供了包含上述β-甘露聚糖酶基因的重組菌株。

為實現上述發明目的，本發明采用以下技術方案予以實現：

本發明提供了酶活性和耐熱性提高的β-甘露聚糖酶突變體MAN-DE01，所述β-甘露聚糖酶突變體MAN-DE01的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示，所述的突變體MAN-DE01由氨基酸序列為SEQ ID NO：1的β-甘露聚糖酶的第339位氨基酸由天冬酰胺變為苯丙氨酸獲得。

本發明提供了酶活性和耐熱性提高的β-甘露聚糖酶突變體MAN-DE02，所述β-甘露聚糖酶突變體MAN-DE02的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示，所述的突變體MAN-DE02由氨基酸序列為SEQ ID NO：1的β-甘露聚糖酶的第246位氨基酸由天冬酰胺變為谷氨酰胺、第339位氨基酸由天冬酰胺變為苯丙氨酸獲得。

本發明提供了酶活性和耐熱性提高的β-甘露聚糖酶突變體MAN-DE03，所述β-甘露聚糖酶突變體MAN-DE03的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示，所述的突變體MAN-DE03由氨基酸序列為SEQ ID NO：1的β-甘露聚糖酶的第50位氨基酸由天冬酰胺變為天冬氨酸、第339位氨基酸由天冬酰胺變為苯丙氨酸獲得。