[發明專利]利用噬菌體展示技術構建細胞穿透肽表達文庫的方法

在審

• 申請號: 201810578660.6
• 申請日: 2018-06-07
• 公開（公告）號: CN108752425A
• 公開（公告）日: 2018-11-06
• 發明（設計）人: 姜勇;劉蕓;羅海華
• 申請（專利權）人: 南方醫科大學
• 主分類號: C07K7/06
• 分類號: C07K7/06;C12N15/70;C40B50/06
• 代理公司: 北京科億知識產權代理事務所(普通合伙) 11350
• 代理人: 趙蕊紅

一種利用噬菌體展示技術構建細胞穿透肽表達文庫的方法，采用噬菌體展示技術，結合全細胞篩選模式，篩選具有細胞膜穿透活性的多肽；再利用所篩選的胞穿透肽構建細胞穿透肽原核表達文庫。選用Ph.D.?C7C噬菌體展示肽庫，將隨機七肽的基因序列插入到噬菌體衣殼蛋白編碼基因pIII中，使隨機七肽對應的表達產物與噬菌體的衣殼蛋白末端形成融合蛋白，從而構建成一個組合文庫。本發明方法所構建的文庫陽性克隆率遠高于隨機多肽文庫，篩選和驗證所需時間周期大大縮短，具有高通量的優勢。

技術領域

本發明涉及生物醫藥領域，特別涉及噬菌體展示、細胞培養技術、原核表達文庫構建和分子熒光技術，具體涉及利用噬菌體展示技術篩選細胞穿透多肽的方法以及利用篩選得到的多肽構建原核表達文庫，從而對多肽的穿透能力進行驗證和比較的方法。

技術背景

細胞膜是一種具半透性的生物膜，其特性構成了細胞內外物質選擇性交換的基礎，因而對于維持細胞的生存和正常功能的發揮具有關鍵性作用。然而，由于存在著這一天然的有效屏障，一些被證明具有良好治療效果和疾病診斷價值的生物大分子和傳感分子，例如非脂溶性的蛋白、抗體、多肽、核酸、極性藥物分子、探針以及顯像劑等卻很難到達細胞內發揮應有的作用。尤其在目前腫瘤藥物靶向的治療研究中，已開發出來的腫瘤單克隆抗體由于只能與細胞膜表面的特異性表位結合，難以攜帶藥物分子進入細胞內部，從而使得細胞內輸送載體的研究也成為該領域關注的焦點。目前已得到應用的顯微注射、脂質體轉染、病毒包被、化學修飾等方法，雖然能夠將物質導入細胞，但是都不同程度地存在著分子活性下降、導入效率低下、細胞種類受限以及造成細胞損傷等問題，多停留在實驗室研究階段，難以推廣和應用于臨床治療。

上世紀末以來，細胞穿透肽(cell-penetratingpeptides,CPPs)得到了陸續發現和深入研究，這一領域開啟了細胞內輸送載體研究的新紀元，細胞穿透肽亦被證明是目前實現細胞內運輸最為有效的手段之一(Adv Drug DeliverRev,2009,61:953-964)。關于CPPs的首次報道出現在1988年，Frankel等發現來源于人免疫缺陷病毒HIV-1轉錄激活因子的蛋白Tat具有穿透細胞膜和核膜，并錨定于特異基因調控區的能力(Cell,1988,55:1189-1193)。隨后研究還發現，Tat蛋白中的一段長度為11個氨基酸殘基的堿性氨基酸序列YGRKKRRQRRR發揮了蛋白轉運的作用(JBiol Chem,1997,272:16010-16017)。此后，來源于果蠅觸角蛋白(antennapediaprotein ofDrosophila)的多肽penetratin被首次成功地運用于外源性肽類的細胞內輸送(J Biol Chem,1994,269:10444-10450)。后續的研究證實，CPPs可以有效的將親水性蛋白質、多肽、核酸片段大分子物質，極性化學分子甚至量子點等，導入種類廣泛的細胞中，不僅能夠保證活性分子正常發揮作用，并且在一定濃度范圍內不會造成細胞損傷。尤其是某些CPPs能夠攜帶貨物分子穿過血腦屏障、血睪屏障、胎盤屏障等人體重要的屏障系統發揮作用(Chem Commun,(Camb.)2005,3144-3146)。因而，CPPs作為有效的生物活性分子細胞內外轉運工具，在細胞生物學、細胞免疫學、藥物開發、基因生物治療以及腫瘤靶向治療等研究領域，均具有廣闊而重要的應用前景(Adv Drug DeliverRev,2009,61:953-964)。