[發明專利]利用噬菌體展示技術構建細胞穿透肽表達文庫的方法

在審

• 申請號: 201810578660.6
• 申請日: 2018-06-07
• 公開（公告）號: CN108752425A
• 公開（公告）日: 2018-11-06
• 發明（設計）人: 姜勇;劉蕓;羅海華
• 申請（專利權）人: 南方醫科大學
• 主分類號: C07K7/06
• 分類號: C07K7/06;C12N15/70;C40B50/06
• 代理公司: 北京科億知識產權代理事務所(普通合伙) 11350
• 代理人: 趙蕊紅

1.一種利用噬菌體展示技術構建細胞穿透肽表達文庫的方法，其特征在于，采用噬菌體展示技術，結合全細胞篩選模式，篩選具有細胞膜穿透活性的多肽；再利用所篩選的胞穿透肽構建細胞穿透肽原核表達文庫。

2.根據權利要求1所述的利用噬菌體展示技術構建細胞穿透肽表達文庫的方法，其特征在于，選用Ph.D.-C7C噬菌體展示肽庫，將隨機七肽的基因序列插入到噬菌體衣殼蛋白編碼基因pIII中，使隨機七肽對應的表達產物與噬菌體的衣殼蛋白末端形成融合蛋白，從而構建成一個組合文庫；

所述全細胞篩選模式是指以培養細胞為對象，加入噬菌體隨機環七肽庫進行的篩選。

3.根據權利要求2所述的利用噬菌體展示技術構建細胞穿透肽表達文庫的方法，其特征在于，包括如下步驟：

0.以噬菌體隨機環七肽庫作為噬菌體篩選基，令篩選次數n＝1，進入步驟a；

a.將噬菌體篩選基加入培養細胞上清中孵育1-2小時；

b.冰上終止反應，棄去上清中未結合噬菌體；

c.培養基洗滌細胞10次以上，以去除細胞表面噬菌體；

d.胰酶消化細胞至圓縮，再進行離心處理，之后反復洗滌細胞3-5次，以去除與細胞膜有特異性結合的噬菌體；

e.細胞沉淀置于液氮和37℃恒溫水浴鍋中反復凍融5-10次，在每次凍融過程中分別震蕩30秒；然后

向凍融物中加入含表面活性劑的緩沖液，于室溫作用1小時以上，以裂解細胞；

f.離心后的裂解上清即為淘選分離液，取100μl淘選分離液測定噬菌體滴度；向其余裂解液中加入對數期大腸桿菌以及含有抗生素的LB培養基10-50ml，再于37℃劇烈振搖培養4-6小時；

g.離心培養物，將70％-90％的上清液上部轉入一新離心管中，加入1/6體積的PEG/NaCl，混勻，并于4℃沉淀過夜；

h.沉淀物重懸于含0.02％NaN₃/TBS緩沖液中，離心上清，再用1/6體積的PEG/NaCl二次沉淀；

i.沉淀物重懸后離心，上清轉入新的離心管，即得到噬菌體擴增液，測定噬菌體滴度；

j.判斷篩選次數n是否小于或者等于篩選截止次數s，s為自然數，如果是，則進入步驟l；如果否則進入步驟k；

k.以步驟i得到的噬菌體擴增液作為噬菌體篩選基，令n＝n+1，返回步驟a；

l.提取經過篩選過后的噬菌體總DNA；

m.用含有酶切位點的上下游引物，以提取的噬菌體單鏈DNA為模板，擴增目的片段，插入帶有熒光蛋白DNA的原核表達載體中；

n.將連接產物轉化入原核表達菌株中，即得到細胞穿透肽原核表達文庫。

4.根據權利要求3所述的利用噬菌體展示技術構建細胞穿透肽表達文庫的方法，其特征在于，噬菌體滴度測定方法為：

1).接種大腸桿菌菌落于培養基中，37℃劇烈振搖，培養至對數中期；

2).取噬菌體淘選分離液和擴增液，在培養集中進行10倍系列稀釋，稀釋范圍為10⁹-10¹¹；

3).當細菌培養物達對數中期時，分成100-200μl等份于微量離心管中，每個噬菌體稀釋度一管；

4).向離心管中每管加入10-20μl不同稀釋度的噬菌體，快速震蕩混勻，室溫孵育感染；

5).將感染的細菌加入預溫的頂層瓊脂玻璃試管中，每次一管，快速混勻，在6分鐘內傾注于37℃預溫的篩選平板上，傾斜平板將上層瓊脂均勻鋪開；

6).待平板冷卻凝固，倒置于37℃培養箱培養過夜；檢查平板，計數10²數量級噬菌斑平板上的斑數，然后用此數目乘以稀釋因子即得到噬菌體的滴度，即空斑形成單位。

5.根據權利要求4所述的利用噬菌體展示技術構建細胞穿透肽表達文庫的方法，其特征在于，篩選截止次數s為3或4。