[發明專利]一種基于DSN酶的量子點-磁珠miRNA傳感器及其制備方法和檢測方法

有效

• 申請號: 201810578304.4
• 申請日: 2018-06-07
• 公開（公告）號: CN108841923B
• 公開（公告）日: 2021-05-18
• 發明（設計）人: 汪聯輝;宇文力輝;譚國梁;朱迪;蘇邵
• 申請（專利權）人: 南京郵電大學
• 主分類號: C12Q1/682
• 分類號: C12Q1/682
• 代理公司: 南京瑞弘專利商標事務所(普通合伙) 32249
• 代理人: 陳國強

本發明公開了一種基于DSN酶的量子點?磁珠miRNA傳感器及其制備方法和檢測方法，通過量子點和磁珠表面共價偶聯的鏈霉親和素和DNA末端修飾的生物素的連接，構建QD?DNA生物探針和MB?DNA生物探針。本發明利用量子點優良的光學特性，基于磁珠的磁分離更省時、分離效果更理想的特點，并且利用DSN酶能夠高選擇性地識別并切割完全匹配的DNA雙鏈或者RNA/DNA雜交雙鏈中的DNA，從而可以實現信號的放大的特點，制備了一種基于DSN酶的量子點?磁珠miRNA傳感器。本發明可以實現對miRNA的高靈敏、高特異性的檢測，在分子生物學和醫學等領域將有潛在的應用。

技術領域

本發明屬于納米生物醫學領域，具體涉及一種基于DSN酶的量子點-磁珠miRNA傳感器及其制備方法和檢測方法。

背景技術

微小核糖核酸(microRNA或miRNA)是一類由18-25個核苷酸構成的非編碼單鏈RNA。miRNA的異常表達在腫瘤中普遍存在，且具有組織特異性，因而可以作為腫瘤檢測的標志物。在腫瘤的早期，血清中的腫瘤miRNA標志物的濃度是非常低的，因此需要設計檢測靈敏度足夠高的傳感器來檢測微量的miRNA。因為miRNA具有超低濃度、序列較短、高的序列同源性和易降解的特性，這些缺點限制了miRNA在臨床檢測中應用，但是也進一步促使人們設計簡單的技術來靈敏地、選擇性地、方便地檢測miRNA?，F如今，很多光學、電化學、拉曼分析方法結合各種放大策略已經被用來檢測miRNA。盡管這些方法可以實現高靈敏和多元檢測，但是一些缺點仍需要被解決，包括實驗時間長、液體或溫度控制設備操作復雜、因放大程序而引起的序列偏差等。熒光檢測因為其操作簡單方便、低消耗、高靈敏度和不需要復雜儀器的特點已經吸引了人們注意。

與傳統的熒光染料相比，量子點(QD)具有許多優良的光學性質，例如：高量子產率、高摩爾消光系數、寬范圍的吸收譜、窄而且對稱的熒光光譜、大的斯托克斯位移、抗光漂白、抗光和抗化學降解能力強。特殊的光學特性使它們在生物成像、傳感和診斷領域吸引了人們廣泛關注。

磁珠(Magnetic Baeds，MB)由一些磁性金屬氧化物組成，磁分離可以實現磁珠的快速聚集，并且磁分離方法與傳統的離心分離方法相比更省時、分離效果更理想還可以起到富集樣品的作用，已經廣泛應用于蛋白質、核酸、多肽等的分離。

雙鏈特異性核酸酶(Duplex-specific nuclease或DSN)能夠高選擇性地識別并剪切DNA雙鏈或DNA-RNA雙鏈中的DNA，但是對于單鏈DNA和RNA卻幾乎沒有作用。基于DSN酶這一個特點使其在生物和醫學等方面得到了廣泛應用。

利用DSN酶信號放大來檢測miRNA已經變成了miRNA檢測的熱點。用DSN酶進行信號放大的原理是用目標miRNA與DNA探針通過雜交形成雙鏈，加入DSN酶剪切DNA-miRNA雙鏈中的DNA，然后，釋放出miRNA與DNA探針雜交，進入下一個循環。循環往復從而將盡可能多的DNA探針剪切，然后檢測DNA探針數量的改變實現miRNA濃度定量檢測。該檢測方法的優點是通過DSN酶的剪切作用，放大檢測信號。該檢測方法不需要進行聚合酶鏈式反應(PCR)，很大程度上避免了非特異性擴增，提高了檢測的特異性。用DSN信號放大機制與不同原理的生物傳感器結合，可以實現對miRNA的超靈敏檢測。

發明內容

本發明的目的是提供一種基于DSN酶的量子點-磁珠miRNA傳感器及其制備方法和檢測方法，用于實現對肺癌miRNA標志物的高靈敏性和高特異性檢測。

為實現上述目的，本發明采用的技術方案是：

一種基于DSN酶的量子點-磁珠miRNA傳感器的制備方法，其步驟是：

通過量子點表面共價偶聯的鏈霉親和素和DNA末端修飾的生物素的連接，構建QD-DNA生物探針；

通過磁珠表面共價偶聯的鏈霉親和素和DNA末端修飾的生物素的連接，構建MB-DNA生物探針。