[發明專利]一種基于DSN酶的量子點-磁珠miRNA傳感器及其制備方法和檢測方法

有效

• 申請號: 201810578304.4
• 申請日: 2018-06-07
• 公開（公告）號: CN108841923B
• 公開（公告）日: 2021-05-18
• 發明（設計）人: 汪聯輝;宇文力輝;譚國梁;朱迪;蘇邵
• 申請（專利權）人: 南京郵電大學
• 主分類號: C12Q1/682
• 分類號: C12Q1/682
• 代理公司: 南京瑞弘專利商標事務所(普通合伙) 32249
• 代理人: 陳國強

1.一種基于DSN酶的量子點-磁珠miRNA傳感器的制備方法，其特征在于：其步驟是：

通過量子點表面共價偶聯的鏈霉親和素和DNA末端修飾的生物素的連接，構建QD-DNA生物探針；

通過磁珠表面共價偶聯的鏈霉親和素和DNA末端修飾的生物素的連接，構建MB-DNA生物探針；

所述MB-DNA生物探針中的DNA序列能夠與目標miRNA-21堿基互補配對形成雙鏈結構；MB-DNA生物探針中的DNA序列能夠與QD-DNA生物探針中的DNA堿基互補配對形成三明治結構。

2.根據權利要求1所述的基于DSN酶的量子點-磁珠miRNA傳感器的制備方法，其特征在于：所述QD-DNA生物探針中，QD和DNA的摩爾比為1：10；MB-DNA生物探針中，MB和DNA的比為6×10^-2 mg：7×10^-5 μmol。

3.根據權利要求1或2所述的基于DSN酶的量子點-磁珠miRNA傳感器的制備方法，其特征在于：所述構建QD-DNA生物探針的步驟為：取SA-QD、Biotin-DNA、封閉液、Tris-HCl緩沖液，加入低吸附離心管中以轉速6000 rpm/min振蕩1～2小時，構建好QD-DNA探針，然后以轉速為4000 rpm超濾5 min，除去未與QD連接的DNA，超濾過程重復3次，最后一次超濾到得到的 QD-DNA探針溶液，加入Tris-HCl緩沖液和封閉液，得到高濃度QD-DNA探針，將構建的高濃度QD-DNA探針分成若干等分，然后每份加入Tris-HCl緩沖液和封閉液，得到QD-DNA生物探針。

4.根據權利要求3所述的基于DSN酶的量子點-磁珠miRNA傳感器的制備方法，其特征在于：所述封閉液為牛血清白蛋白和吐溫-20的混合水溶液，其中，牛血清白蛋白的濃度為0.1mg/mL，吐溫-20的質量濃度為0.1 % 。

5.根據權利要求1或2所述的基于DSN酶的量子點-磁珠miRNA傳感器的制備方法，其特征在于：所述構建MB-DNA生物探針的步驟為：取MB、Biotin-DNA、MB-DNA緩沖液，加入到低吸附離心管中以轉速為6000 rpm/min振蕩1～2小時，構建好MB-DNA探針，然后磁分離清洗，加入Tris-HCl緩沖液，得到高濃度的MB-DNA探針；將高濃度的MB-DNA探針溶液分成若干等分，每份再加入雜交緩沖液，得到MB-DNA生物探針。

6.根據權利要求5所述的基于DSN酶的量子點-磁珠miRNA傳感器的制備方法，其特征在于：振蕩過程中，每隔30 min將離心管中溶液混勻一次，使MB與DNA能夠充分連接。

7.根據權利要求5所述的基于DSN酶的量子點-磁珠miRNA傳感器的制備方法，其特征在于：所述MB-DNA緩沖液的組成為：濃度為5 mM的Tris-HCl，濃度為1M的NaCl，余量為水；MB-DNA緩沖液的pH=7.4。

8.一種由權利要求1-7任一所述的方法制備得到的基于DSN酶的量子點-磁珠miRNA傳感器。

9.一種權利要求8所述的基于DSN酶的量子點-磁珠miRNA傳感器的非診斷為目的檢測方法，其特征在于：包括以下步驟：

步驟a，將MB-DNA探針與目標miRNA-21堿基互補配對，形成雙鏈結構，加入DSN非特異性剪切DNA-RNA雙鏈中的DNA，釋放出游離的目標miRNA-21，miRNA-21繼續與未被剪切的MB-DNA探針雜交形成雙鏈結構，則DSN繼續剪切，循環往復直到將MB-DNA剪切完畢；加入MB-DNA探針的濃度為3.2 mg/mL，反應的溫度為50 ℃，反應時間為90 min，反應DSN酶濃度為1 U；反應結束后加入2×DSN stop溶液5 μL，在混勻儀中輕微振蕩5 min，然后磁分離5 min，除去上清液；

步驟b，DSN剪切DNA-RNA雙鏈結束后，在剩余的MB-DNA探針中加入QD-DNA探針，通過堿基互補配對形成三明治結構，磁分離后，有些QD-DNA探針未被捕獲而游離在上清液中，通過檢測上清液中QD的熒光強度，發現隨著目標miRNA濃度的增大，量子點的熒光強度逐漸增大，通過對比未加入目標miRNA的熒光強度，來實現對目標miRNA的定性和定量檢測；加入的QD-DNA探針的濃度為0.4 μM。