[發明專利]一種基于多巴胺修飾的三元量子點的間接免疫熒光檢測疾病標志物的方法

有效

• 申請號: 201810577449.2
• 申請日: 2018-06-07
• 公開（公告）號: CN108761061B
• 公開（公告）日: 2021-03-16
• 發明（設計）人: 韓志鐘;陳麗;陳敬華;李春艷
• 申請（專利權）人: 福建醫科大學
• 主分類號: G01N33/533
• 分類號: G01N33/533
• 代理公司: 福州智理專利代理有限公司 35208
• 代理人: 王義星

1.一種多巴胺功能化的三元量子點CuInS₂/ZnS的制備方法，包括如下步驟：

1）三元量子點CuInS₂/ZnS的制備

（1）儲備液的制備：將0.0034g氯化銅溶解于20mL去離子水中獲得0.01M銅儲備溶液；將1.106g三氯化銦溶解在5mL乙醇中制備1M銦儲備溶液；將2.3528g檸檬酸鈉溶解于20mL去離子水中獲得0.4M檸檬酸鈉儲備溶液；將2.408g硫化鈉溶解于10mL去離子水中制備1M Na₂S儲備溶液；將0.176g醋酸鋅，0.061g硫脲和0.368g L-谷胱甘肽溶解于20mL去離子水中，用1M NaOH水溶液將pH值調節至5.5?6.6，獲得0.04M ZnS殼儲備溶液；將上述所有制備的儲備溶液在室溫中儲存并在兩周內使用；

（2）三元量子點CuInS₂/ZnS的制備：將1mL步驟（1）獲得的銅儲備溶液，0.04mL步驟（1）獲得的銦儲備溶液，0.40mL步驟（1）獲得的檸檬酸鈉儲備溶液，0.0061g L-谷胱甘肽和20mL去離子水置于50mL三頸燒瓶中；隨后，在磁力攪拌下將0.062mL步驟（1）獲得的Na₂S儲備液加入上述的50mL三頸燒瓶中，調節其pH為5.5，在100℃下反應40min獲得三元量子點CuInS₂反應溶液；將1mL步驟（1）獲得的ZnS殼儲備溶液加入三元量子點CuInS₂反應溶液中反應45min，再重復加入3次，最后得到三元量子點CuInS₂/ZnS；

2）多巴胺功能化的三元量子點CuInS₂/ZnS的制備

首先將10mL0.2M步驟1）獲得的CuInS₂/ZnS量子點溶液放入燒瓶中，加入0.1mL 3-巰基丙酸，將其pH值調節至10.8獲得混合物，其中三元量子點CuInS₂/ZnS在500nm的激發光激發下的最大發射波長為750nm，隨后，將該混合物加熱至100℃，并在該溫度下反應1.5h，獲得羧基修飾的三元量子點CuInS₂/ZnS；然后，在攪拌下加入2mL濃度為0.1M的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽，反應35min后，在攪拌下注入2mL濃度為0.1M的N-羥基琥珀酰亞胺反應1h，隨后將所制備的溶液用異丙醇洗滌并分散在10mL濃度為0.05M，pH=6.5磷酸鉀緩沖溶液（KBS）中，獲得三元量子點CuInS₂/ZnS；將不同量的多巴胺加入到上述的三元量子點CuInS2/ZnS中，將pH保持在6.5，通氮氣除去溶解的氧氣，將此反應混合物放置2h，獲得多巴胺功能化的三元量子點CuInS₂/ZnS（CuInS₂/ZnS QDs-DA），然后于4℃下儲存直至使用。

2.一種基于多巴胺修飾的三元量子點的間接免疫熒光檢測疾病標志物的試劑盒，包括權利要求1所述的100μL濃度為400μM的CuInS₂/ZnS QDs-DA、100μL的TYR-Tau抗體、包被親和素的96孔板、100μL濃度為1μM的Tau適配體溶液和100μL的Tau蛋白；

所述TYR-Tau抗體的制備方法，包括如下步驟：

1）將酪氨酸酶（TYR）和Tau蛋白檢測抗體分別溶解在濃度為0.05M，pH=6.5的KBS中獲得酪氨酸酶的KBS溶液和Tau抗體的KBS溶液；2）通過將N-羥基琥珀酰亞胺-疊氮化物（NHS-疊氮化物）和N-羥基琥珀酰亞胺-二苯并環辛基（NHS-DBCO）分別溶解在二甲基亞砜中獲得NHS-疊氮化物的二甲基亞砜溶液和NHS-DBCO的二甲基亞砜溶液；3）將100μL濃度為100nM酪氨酸酶的KBS溶液與5μL濃度為100μM的NHS-疊氮化物的二甲基亞砜溶液混合，同時，將100μL濃度為100nM的Tau蛋白檢測抗體的KBS溶液和5μL濃度為100μM的NHS-DBCO的二甲基亞砜溶液混合，將此反應溶液在室溫下溫育30min直至綴合反應完成，隨后，將5μL濃度為1M、pH=8的Tris-HCl加入到上述反應溶液中反應5min，使反應終止，獲得Tau抗體-DBCO和TYR-疊氮化物綴合物；4）采用分子量為30K的超濾離心管分別純化Tau抗體-DBCO和TYR-疊氮化物綴合物，之后，通過將50μL濃度為100nM的Tau抗體-DBCO溶液與50μL濃度為100nM的TYR-疊氮溶液混合，在室溫下反應2h，獲得TYR-Tau抗體。