[發明專利]一種篩選蛋白混合物中活性多肽的方法

有效

• 申請號: 201810574116.4
• 申請日: 2018-06-06
• 公開（公告）號: CN108872587B
• 公開（公告）日: 2019-12-27
• 發明（設計）人: 萬江陵;盛劍勇;楊曉宇;楊祥良;劉衛;饒榮
• 申請（專利權）人: 華中科技大學
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;C07K1/04
• 代理公司: 11002 北京路浩知識產權代理有限公司
• 代理人: 王瑩;吳歡燕

本發明提供了一種篩選蛋白混合物中活性多肽的方法。該方法包括：1)對蛋白混合物的二級質譜數據進行從頭測序；2)根據步驟1)所得到的從頭測序結果中各多肽組分的相對強度、可信度、離子匹配情況及特定氨基酸含量，篩選出所述蛋白混合物中可能存在的活性組分；3)將步驟2)得到的活性組分進行固相合成，得到多肽單體；4)比較步驟3)得到的多肽單體的液質圖譜與所述蛋白混合物的液質圖譜，確定所述蛋白混合物中活性多肽。本發明提供的篩選蛋白混合物中活性多肽的方法能夠合理有效地篩選出蛋白混合物中潛在的活性多肽組分，尤其適用于核桃粕水解物。

技術領域

本發明涉及多肽篩選技術領域，更具體地，涉及一種篩選蛋白混合物中活性多肽的方法。

背景技術

目前，鑒定蛋白混合物中多肽組分的方法主要分為以下三種：第一種是通過提取分離純化的方法，得到高純度的多肽單體后，使用多肽N端測序技術確定多肽序列。該方法需要使用分子篩、離子色譜、高效液相色譜等分離技術對蛋白混合物中各多肽組分進行分離純化，步驟繁瑣，耗時長。且各種分離純化方法的分辨率有限，對于成分復雜的蛋白混合物難以實現目標活性組分與其他組分的完全分離，因此一般只能同時研究蛋白混合物中一個或少數幾個多肽組分。第二種是對蛋白混合物進行HPLC-MS/MS檢測，得到多肽組分的二級質譜信息。使用蛋白質組測序的方法，將二級質譜信息與現有蛋白質組數據庫信息進行匹配與解析，確定多肽序列。該方法需要有蛋白質來源物種的基因組學數據庫或蛋白質組學數據庫。此外，蛋白混合物的制備工藝必須有確切的酶切位點，因此適用范圍受限。第三種是使用從頭測序的方法對蛋白混合物的HPLC-MS/MS圖譜進行解析，得到各多肽組分的序列。該方法無需特定物種的蛋白質組學數據庫，通過計算機運算得到多肽的結構信息。通過從頭測序的方法。從頭測序得到的結果數據量龐大且會存在一些與真實情況不符的錯誤。因此，需要建立一種科學合理的方法在測序結果中篩選出更容易檢測、更具有結構代表性、真實存在的多肽組分，以縮小范圍，再進行活性篩選。

核桃(Juglans regia L.)具有抗氧化、抗炎、抗動脈粥樣硬化等多種生理活性。核桃制油剩余的核桃粕中蛋白含量在30％以上，核桃粕水解物是由核桃粕經蛋白酶水解得到的產物，含有豐富的活性多肽。研究表明，核桃粕水解物具有很好的抗氧化、增強學習與記憶、降血壓、抗腫瘤等活性。目前對核桃粕水解物的功效研究較多，但是產生這些功效的物質基礎研究甚少。大部分研究僅僅將核桃粕水解物整體，也就是包含活性肽、多酚等物質的混合物作為研究對象，而并未對其中各個多肽組分的生物活性深入研究。此外，由于缺乏科學的質控指標，使得核桃粕水解物產品的質量控制造成了困難。多肽是核桃粕水解物的主要成分之一，已被證明具有增強學習與記憶的作用。因此，對核桃粕水解物中多肽的組成進行鑒定既有利于獲得具有較高生物學活性的單體，又有利于更科學地制定核桃粕水解物的質量標準。

由于目前沒有公開的核桃基因組學數據庫或蛋白質組學數據庫，且核桃粕水解物組分繁多，因此核桃粕水解物中多肽組分的鑒定適用前述的第三種方法，是建立活性多肽篩選方法的合適研究對象。

發明內容

本發明的第一目的在于提供一種篩選蛋白混合物中活性多肽的方法。該方法包括以下步驟：

1)對蛋白混合物的二級質譜數據進行從頭測序；

2)根據步驟1)所得到的從頭測序結果中各多肽組分的相對強度、可信度、離子匹配情況及特定氨基酸含量，篩選出所述蛋白混合物中可能存在的活性組分；其中，所述特定氨基酸為所述蛋白物混合物中的主要氨基酸；

3)將步驟2)得到的活性組分進行固相合成，得到多肽單體；

4)比較步驟3)得到的多肽單體的液質圖譜與所述蛋白混合物的液質圖譜，確定所述蛋白混合物中活性多肽。

本發明提供的方法可以合理有效地篩選出未知蛋白混合物中的活性多肽。