[發(fā)明專利]一種高產(chǎn)角質酶的重組大腸桿菌工程菌及其發(fā)酵工藝

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810570043.1
• 申請日: 2018-06-05
• 公開（公告）號: CN108753671A
• 公開（公告）日: 2018-11-06
• 發(fā)明（設計）人: 吳敬;宿玲恰;孫益榮;洪若宇
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N9/18;C12R1/19
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產(chǎn)權代理有限公司 23211
• 代理人: 張勇

1.一種高產(chǎn)角質酶的重組大腸桿菌工程菌，其特征在于，所述工程菌包含重組質粒和表達宿主；所述重組質粒包含目的基因以及表達載體；所述目的基因為角質酶基因；所述表達載體為pET-20b(+)；所述表達宿主為E.coli BL21(DE3)。

2.如權利要求1所述的一種高產(chǎn)角質酶的重組大腸桿菌工程菌，其特征在于，所述角質酶基因來源于特異腐質霉(Humicola insolens)。

3.一種生產(chǎn)角質酶的方法，其特征在于，所述方法為使用權利要求1或2所述的一種高產(chǎn)角質酶的重組大腸桿菌工程菌作為生產(chǎn)菌株。

4.如權利要求3所述的一種生產(chǎn)角質酶的方法，其特征在于，所述方法為將重組大腸桿菌工程菌菌液接入發(fā)酵培養(yǎng)基，通過調節(jié)攪拌轉速或通入富氧空氣或氧氣的方式將發(fā)酵過程中的溶氧維持在25％～35％，溫度控制在35℃～38℃，流加質量濃度為20％～30％的氨水控制pH為6.0～8.0，培養(yǎng)4h～8h，進行分批發(fā)酵；分批發(fā)酵階段結束后待溶氧上升至80％～100％，以指數(shù)流加的方式補加補料液控制菌體以0.15h^-1～0.25h^-1的比生長速率生長，通過提高攪拌轉速或者通入富氧空氣或氧氣維持溶氧在25％～35％，溫度控制在35℃～38℃，流加質量濃度為20％～30％的氨水控制pH為6.0～8.0進行補料發(fā)酵；當補料發(fā)酵至菌體OD₆₀₀達到70～80時，將溫度降為25℃～35℃，采用恒速流加的方式流加乳糖，流速控制在0.7g·L^-1·h^-1～0.9g·L^-1·h^-1，通過提高攪拌轉速或者通入富氧空氣或氧氣維持溶氧在25％～35％，流加質量濃度為20％～30％的氨水控制pH為6.0～8.0，培養(yǎng)7h～9h，進行誘導發(fā)酵。

5.如權利要求4所述的一種生產(chǎn)角質酶的方法，其特征在于，所述重組大腸桿菌工程菌菌液在發(fā)酵培養(yǎng)基中的接種量為8～12％。

6.如權利要求4或5所述的一種生產(chǎn)角質酶的方法，其特征在于，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的成分包含7～9g/L的甘油、0.5～2g/L的蛋白胨、1～3g/L的酵母粉、13～14g/L的KH₂PO₄、3～5g/L的(NH₄)₂HPO₄、1～2g/L的檸檬酸、0.5～1g/L的MgSO₄以及9～11mL/L微量元素液。

7.如權利要求6所述的一種生產(chǎn)角質酶的方法，其特征在于，所述微量元素液的成分包含4～6mol/L的HCl、9～11g/L的FeSO₄·7H₂O、2～3g/L的ZnSO₄·7H₂O、0.5～1.5g/L的CuSO₄·5H₂O、0.2～0.7g/L的MnSO₄·4H₂O、0.1～0.3g/L的Na₂B₄O₇·10H₂O、1～3g/L的CaCl₂以及0.05～0.15g/L的(NH₄)₆Mo₇O₂₄。

8.如權利要求4-7任一所述的一種生產(chǎn)角質酶的方法，其特征在于，所述指數(shù)流加的速率由公式得到；

其中，X和S分別為細胞和底物濃度(g/L)；

μ為為比生長速率(h^-1)；

V為發(fā)酵液體積(L)；

SF為補加底物的濃度(g/L)；

YX/S為細胞對底物的得率系數(shù)(g/g)；

(VX)₀為培養(yǎng)體系的初始細胞量(g)；

t為流加時間(h)。