[發明專利]一種高產角質酶的重組大腸桿菌工程菌及其發酵工藝

在審

• 申請號: 201810570043.1
• 申請日: 2018-06-05
• 公開（公告）號: CN108753671A
• 公開（公告）日: 2018-11-06
• 發明（設計）人: 吳敬;宿玲恰;孫益榮;洪若宇
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N9/18;C12R1/19
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 張勇

本發明公開了一種高產角質酶的重組大腸桿菌工程菌及其發酵工藝，屬于基因工程以及發酵工程技術領域。本發明以Humicola isnolens來源的角質酶基因為目的基因，pET?20b(+)為表達載體，E.coli BL21(DE3)為表達載體，成功構建了可高效活性表達角質酶的基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET?20b(+)/hic；同時，本發明創造性地以重組大腸桿菌基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET?20b(+)/hic為生產菌株，采用兩階段溫度控制工藝、恒定溶氧控制工藝、pH控制工藝、補料分批發酵工藝、高誘導菌體濃度結合高誘導強度的誘導控制工藝相結合的生產工藝以生產角質酶，具有產量高，原料來源廣泛，生產成本較低等優勢。

技術領域

本發明涉及一種高產角質酶的重組大腸桿菌工程菌及其發酵工藝，屬于基因工程以及發酵工程技術領域。

背景技術

角質酶是一種多功能水解酶，可用于水解短鏈或長鏈脂肪酸酯和甘油三酯，也可用于降解植物的多聚體角質。

相較于脂肪酶，角質酶無蓋子結構，更易于降解聚酯，因此，角質酶在農產品深加工、護理用品行業、紡織工業等方面都得到了廣泛的應用，尤其在棉織物的生物精煉和人造纖維的表面改性中，角質酶有望替代傳統的化學堿處理，對環境保護有重要意義。

角質酶有多種來源，其中，特異腐質霉(Humicola insolens)來源的角質酶熱穩定性好，應用于棉織物精煉中時無需預處理，可有效簡化工藝流程；但在實際使用中，由于此來源的角質酶在菌中的產量低下以及現有發酵工藝的制約，以此來源的角質酶進行發酵生產的成本太高，這一缺陷大大限制了其工業大規模應用。

目前，常采用構建基因工程菌(Pichia pastori、Escherichia coli、Fusariumvenenatum等)和優化發酵工藝(培養基和誘導條件等)等方法提升角質酶產量，這些方法也取得了一定效果。

但是，從基因工程菌的角度來說，已有的將特異腐質霉(Humicola insolens)來源的角質酶在菌中異源表達得到的基因工程菌，其角質酶產量并未有顯著提高，其產出的角質酶活性也十分低下；從發酵工藝的角度來說，現在也缺乏針對角質酶自身功能特性進行發酵工藝特異性優化的策略。

因此，雖然H.insolens角質酶在工業生產中有光明的應用前景，但如何提高其產量，如何對其發酵工藝進行優化，仍需進一步研究。

發明內容

為解決上述問題，本發明以特異腐質霉(Humicola insolens)來源的角質酶基因為目的基因，pET-20b(+)為表達載體，E.coli BL21(DE3)為表達宿主，成功構建了可表達角質酶的基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET-20b(+)/hic；同時，本發明創造性地以重組大腸桿菌基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET-20b(+)/hic為生產菌株，采用兩階段溫度控制工藝、恒定溶氧控制工藝、pH控制工藝、補料分批發酵工藝、高誘導菌體濃度結合高誘導強度的誘導控制工藝相結合的生產工藝以生產角質酶，具有產量高，原料來源廣泛，生產成本較低等優勢。

本發明的技術方案如下：

本發明提供了一種高產角質酶的重組大腸桿菌工程菌，所述工程菌包含重組質粒和表達宿主；所述重組質粒包含目的基因以及表達載體；所述目的基因為角質酶基因；所述表達載體為pET-20b(+)；所述表達宿主為E.coli BL21(DE3)。

在本發明的一種實施方式中，所述角質酶基因來源于特異腐質霉(Humicolainsolens)。

在本發明的一種實施方式中，所述角質酶基因的核苷酸序列為SEQ ID NO.1。

在本發明的一種實施方式中，所述重組質粒是通過將角質酶基因插入表達載體pET-20b(+)的信號肽序列下游構建而成的。