[發(fā)明專利]一種鑒別CCoVI和CCoVII的雙重納米PCR檢測方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810569666.7
• 申請日: 2018-06-05
• 公開（公告）號: CN108676917B
• 公開（公告）日: 2022-04-12
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 崔尚金;秦彤
• 申請（專利權(quán)）人: 中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/686;C12R1/93
• 代理公司: 北京市誠輝律師事務(wù)所 11430
• 代理人: 梁婧文

本發(fā)明公開了一種鑒別CCoVⅠ和CCoVⅡ的nanoRT?PCR檢測方法。通過對nanoRT?PCR反應(yīng)體系的引物、退火溫度和引物濃度進行優(yōu)化，獲得CCoVⅠ和CCoVⅡ各自的目的條帶的高效擴增，同時避免引物間的非特異性擴增；本發(fā)明所述nanoRT?PCR檢測方法的最低核酸檢測量比普通RT?PCR高100倍，且通過nanoRT?PCR擴增得到與預(yù)期片段大小一致且序列完全正確的產(chǎn)物。本發(fā)明提供的用于鑒別CCoVⅠ和CCoVⅡ的nanoRT?PCR方法具有極高的靈敏度和特異性，是一種高效的檢測手段，可應(yīng)用于犬冠狀病毒病的流行性調(diào)查，同時也為CCoV的鑒定和防控奠定基礎(chǔ)，具有重大的實際意義和價值。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種鑒別CCoVI和CCoVII的雙重納米RT-PCR檢測方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

犬冠狀病毒(Canine coronavirus，CCoV)是引起犬胃腸炎的主要病原之一，一般引起幼齡犬發(fā)生非致死性的輕度腹瀉，呈現(xiàn)高發(fā)病率、低死亡率的特點，當與其他腸道病原混合感染時，能導(dǎo)致患病動物高死亡率。近年來，隨著CCoV高致病性的變異毒株在歐洲國家陸續(xù)報道，該病再一次引起了廣泛的關(guān)注[1-2]。

CCoV為單股正鏈RNA病毒，屬套式病毒目、α冠狀病毒科、α冠狀病毒屬[3]。近年來檢測到CCoV有不同的基因型，分為CCoV I型(CCoVI)和CCoVⅡ型(CCoVII)[4]。CCoVⅡ是自1971年以來已知的最早的基因型[5]，由于CCoVI尚未適應(yīng)體外生長，不能通過細胞培養(yǎng)分離得到，依靠分子方法才在30年后被發(fā)現(xiàn)[6]。CCoV基因組序列包括10個開放閱讀框，從5′到3′依次編碼1a、1b、纖突蛋白、小膜蛋白、膜蛋白(M)、核衣殼蛋白以及許多假定的非結(jié)構(gòu)蛋白。對CCoV M基因的氨基酸序列進行比對分析，在CCoVⅡ跨膜區(qū)和羧基末端，只有少數(shù)分散的替換，而CCoV I的M蛋白中發(fā)生許多類似于貓冠狀病毒典型殘基的替換，基于此可以區(qū)分I型和Ⅱ型[7]。由于冠狀病毒不僅在宿主中易突變，而且在病毒間也易發(fā)生基因重組，從而導(dǎo)致近年來新變異株不斷出現(xiàn)。另外，CCoVI和CCoVⅡ的感染在臨床診斷上是無法區(qū)分的，只能依靠生物技術(shù)對其進行序列分析后才能得到鑒別，所以建立一個簡便有效、特異性高和靈敏性強的檢測方法很有必要。

目前，檢測CCoV的技術(shù)主要有普通RT-PCR、核酸探針、熒光定量RT-PCR及ELISA等：(1)RT-PCR是比較常見的技術(shù)，但其缺陷在于敏感性不顯著；(2)核酸探針技術(shù)費用較高，不適用于大批量樣本的檢測；(3)熒光定量RT-PCR的敏感性和準確性高于普通RT-PCR，但其實施需要昂貴的實時熒光定量PCR儀，在二三線城市的動物診所或?qū)嶒炇译y以普及推廣；(4)間接ELISA法對樣品的要求比較高，且操作程序復(fù)雜，耗時長。以上這些缺點限制了上述方法在臨床診斷中的應(yīng)用。

納米PCR是一種敏感、便捷的新型PCR技術(shù)，其原理是在納米PCR緩沖液中添加了粒徑為1nm～100nm的納米金屬顆粒，當反應(yīng)時產(chǎn)生具有超強導(dǎo)電性的納米流體，從而加快溫度升高和下降的速度，減少在非目標溫度的停留時間，因而減少了反應(yīng)非特異性擴增，同時提高了擴增效率和敏感性。該方法目前仍未適用于犬科病毒，尤其是CCoVI和CCoVII的鑒定檢測當中。

參考文獻：

[1]Zicola A，Jolly S，Mathijs E，et al.Fatal outbreaks in dogsassociated with pantropic canine coronavirus in France and Belgium[J].SmallAnim.Pract，2012，53:297–300.18.

[2]Decaro N，Cordonnier N，Demeter Z，et al.European surveillance forpantropic canine coronavirus[J].Clin Microbiol，2013，51(1):83–88.