[發明專利]杜鵑芽枯萎病菌實時熒光PCR檢測方法及其專用成套試劑

有效

• 申請號: 201810567491.6
• 申請日: 2018-06-05
• 公開（公告）號: CN108707689B
• 公開（公告）日: 2022-04-05
• 發明（設計）人: 段維軍;郭立新;段麗君;李雪蓮;張慧麗;陳先鋒
• 申請（專利權）人: 寧波檢驗檢疫科學技術研究院
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/686;C12Q1/04;C12R1/645
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢;魏少偉

本發明公開了杜鵑芽枯萎病菌實時熒光PCR檢測方法及其專用成套試劑。本發明公開的檢測杜鵑芽枯萎病菌的成套試劑由名稱為SA的引物對和名稱為SA?P的探針組成，SA由名稱分別為SA?F和SA?R的單鏈DNA組成；SA?F為序列表的序列1所示的單鏈DNA分子；SA?R為序列表的序列2所示的單鏈DNA分子；SA?P的核苷酸序列為序列表的序列3。實驗證明，本發明的成套試劑檢測杜鵑芽枯萎病菌操作快速簡單、特異性強、靈敏度高、交叉污染低，且可以實現定量檢測，對于杜鵑芽枯病菌的檢測以及防控具有重大的應用推廣價值。

技術領域

本發明涉及生物技術領域中，杜鵑芽枯萎病菌實時熒光PCR檢測方法及其專用成套試劑。

背景技術

杜鵑芽枯病菌Seifertia azaleae，隸屬于真菌界(Fungi)、子囊菌門Ascomycota、散囊菌綱Eurotiomycetes、刺盾炱目Chaetothyiales、小蔓毛殼科 Herpotrichiellaceae。

杜鵑芽枯病菌已被列入我國進境植物檢疫性有害生物名錄，是一種檢疫性植物病原真菌。目前，該病菌分布于波蘭、日本、北美，主要為害花芽、葉芽和嫩枝，嚴重 時可造成整株枯死。

迄今為止，國內外檢測杜鵑芽枯病菌的方法局限于形態學檢測方法，費時費力，耗時較長，需要15天以上，且容易漏檢，出現假陰性結果，且對檢測人員專業素質要 求較高，難以滿足快速、準確、靈敏鑒定的檢測要求。

發明內容

本發明的目的是提供一種杜鵑芽枯萎病菌實時熒光PCR檢測方法及其專用成套試劑。

本發明首先提供了一種成套試劑，所述成套試劑由名稱為SA的引物對和名稱為SA-P的探針組成，所述SA由名稱分別為SA-F和SA-R的單鏈DNA組成；

所述SA-F為如下(a1)或(a2)：

(a1)序列表的序列1所示的單鏈DNA分子；

(a2)將序列1經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列1具 有相同功能的DNA分子；

所述SA-R為如下(a3)或(a4)：

(a3)序列表的序列2所示的單鏈DNA分子；

(a4)將序列2經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列2具 有相同功能的DNA分子；

所述SA-P的核苷酸序列為如下(a5)或(a6)：

(a5)序列表的序列3；

(a6)將序列3經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列3具 有相同功能的序列。

所述SA-P的兩端可分別帶有熒光報告基團和熒光淬滅基團。具體的，所述SA-P 的5'末端具有熒光報告基團FAM，3'末端具有熒光淬滅基團MGB。探針完整時，報告 基團發射的熒光信號被淬滅基團吸收，進行PCR擴增時，DNA聚合酶的5'-3'外切酶活 性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，發出熒光信號，從而使熒 光信號的累積與PCR產物形成完全同步。

所述成套試劑的用途可為如下(b1)、(b2)、(b3)或(b4)：

(b1)鑒定杜鵑芽枯萎病菌；

(b2)制備用于鑒定杜鵑芽枯萎病菌的試劑盒；

(b3)檢測待測樣本是否含有杜鵑芽枯萎病菌；

(b4)制備用于檢測待測樣本是否含有杜鵑芽枯萎病菌的試劑盒。

上述成套試劑中，所述SA-F、所述SA-R、所述SA-P均可獨立包裝。所述SA-F、 所述SA-R、所述SA-P的摩爾比可為1:1:1。