[發明專利]檢測植物病原性輪枝菌的特異引物對、探針和試劑盒及其應用

在審

• 申請號: 201810566515.6
• 申請日: 2018-06-05
• 公開（公告）號: CN108707688A
• 公開（公告）日: 2018-10-26
• 發明（設計）人: 段維軍;郭立新;段麗君;陳先鋒
• 申請（專利權）人: 寧波檢驗檢疫科學技術研究院
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/645
• 代理公司: 杭州云睿專利代理事務所(普通合伙) 33254
• 代理人: 張驍敏

本發明公開了一種檢測植物病原性輪枝菌的特異引物對、探針和試劑盒及其應用。本發明首先提供了一種特異引物對，由序列表的序列1所表示的引物VF和序列表的序列2所表示的引物VR組成。本發明還提供一種引物探針組，包括所述特異引物對和探針，所述探針由序列表的序列3所表示。本發明還提供所述特異引物對或所述引物探針組的應用，為如下(b1)、(b2)、(b3)或(b4)：(b1)鑒定植物病原性輪枝菌；(b2)制備用于鑒定植物病原性輪枝菌的試劑盒；(b3)檢測待測樣本是否含有植物病原性輪枝菌；(b4)制備用于檢測待測樣本是否含有植物病原性輪枝菌的試劑盒。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及檢測植物病原性輪枝菌的特異引物對、探針和試劑盒，及利用其進行實時熒光PCR的檢測方法和相關應用。

背景技術

輪枝菌屬(Verticillium)由Nees在1817年建立，其中危害植物的種類主要包括以下10個種，即黑白輪枝菌Verticillium albo-atrum、苜蓿輪枝菌Verticillium alfalfae、大麗輪枝菌Verticillium dahliae、Verticillium isaacii、Verticillium klebahnii、長孢輪枝菌Verticillium longisporum、非苜蓿輪枝菌Verticillium nonalfalfae、云狀輪枝菌Verticillium nubilum、三體輪枝菌Verticillium tricorpus、Verticilliumzaregamsianum。在這10種輪枝菌中，以同為土壤習居菌的大麗輪枝菌和黑白輪枝菌危害最為嚴重，可引起植物維管束病害，造成作物減產，甚至絕產，屬于我國重要植物檢疫對象。

有害生物入侵的超前預警、快速檢測、風險分析和科學控制是防范外來物種的核心內容，其中，有害生物鑒定是其中的首要環節。對大麗輪枝菌和黑白輪枝菌及其近似種進行有效識別，對于控制其危害，及時阻斷其傳播、擴散，起著至關重要的作用。目前，我國進出境口岸對檢疫性輪枝菌種類鑒定的主要依據標準是根據其形態學特征進行，由于輪枝狀分生孢子梗形成需要較長時間，且觀察不易，故單純依據形態特征進行該屬病菌區分具有一定難度。

為了解決上述問題，現有技術中雖然公開了有關大麗輪枝菌(一種PCR快速檢測大麗輪枝菌的方法及其試劑盒，CN103333969A)和黑白輪枝菌(一種檢測黑白輪枝菌的實時熒光PCR檢測試劑，CN104263824A)的實時熒光PCR檢測方法及試劑盒，但都具有一定的檢測局限性，只能較為準確地檢測出一種輪枝菌，普適性較差，在檢疫性鑒定應用方面存在缺陷，不能滿足口岸日常檢測篩查的需要。

發明內容

為了解決現有技術的問題，本發明提供檢測植物病原性輪枝菌的特異引物對、探針和試劑盒及其應用，能夠針對多種植物病原性輪枝菌進行快速、準確地檢測。

為實現上述目的，本發明是采用由以下技術措施構成的技術方案來實現的。

一種特異引物對，由引物VF和引物VR組成；

所述引物VF為如下(a1)或(a2)：

(a1)序列表的序列1所示的單鏈DNA分子；

(a2)將序列1經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列1具有相同功能的DNA分子；

所述引物VR為如下(a3)或(a4)：

(a3)序列表的序列2所示的單鏈DNA分子；

(a4)將序列2經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列2具有相同功能的DNA分子。

所述特異引物對的用途為如下(b1)、(b2)、(b3)或(b4)：

(b1)鑒定植物病原性輪枝菌；

(b2)制備用于鑒定植物病原性輪枝菌的試劑盒；