[發明專利]通過檢測糞便確定人體內植物性來源小RNA的方法

在審

• 申請號: 201810566237.4
• 申請日: 2018-05-22
• 公開（公告）號: CN108753940A
• 公開（公告）日: 2018-11-06
• 發明（設計）人: 樊龍江;孫碩
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12Q1/6869
• 分類號: C12Q1/6869;G06F19/22
• 代理公司: 杭州中成專利事務所有限公司 33212
• 代理人: 周世駿

1.通過檢測糞便確定人體內植物性來源小RNA的方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)以常規方法采集人類糞便樣品；

(2)利用RNA提取試劑盒提取糞便樣品的總RNA；

(3)按照常規小RNA建庫流程和方法，構建小RNA文庫；

(4)利用高通量測序技術平臺對糞便樣品中的小RNA進行高通量測序；

(5)對測序結果進行小RNA數據的生物信息學分析，以確定人體內植物來源的miRNA及其豐度。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)所用RNA提取試劑盒是下述的任意一種：BIOG RNA Stool Kit糞便RNA提取試劑盒、Stool RNA Kit(200)糞便RNA提取試劑盒、強力糞便RNA提取試劑盒PowerMicrobiome RNA Isolation Kit。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)所用RNA提取試劑盒是BIOGRNA Stool Kit糞便RNA提取試劑盒，由吸附柱、收集管、裂解液Ⅰ、裂解液Ⅱ、析出液、洗滌液、洗脫液和消化液組成，另自行準備好無水乙醇、PBS和1.6mL離心管；步驟(2)的具體操作步驟如下：

(1)取出試劑盒中的析出液和洗滌液，按以下操作：

a)析出液：4.5mL加入25.5mL無水乙醇；9mL加入51mL無水乙醇；

b)洗滌液：9mL加入21mL無水乙醇；18mL加入42mL無水乙醇；

c)配制好的析出液如出現沉淀，將其在37℃溶解，搖勻后使用；

(2)取200mg的糞便于試管中，若糞便樣本為液態則取200μL于試管中；加入2mL PBS充分振蕩混勻，300g離心5分鐘，收集上清；取收集的上清液1mL于1.5mL離心管中，12000rpm離心5分鐘，棄上清后沉淀用1mL PBS重懸，振蕩混勻后，12000rpm離心5分鐘，收集沉淀；

(3)加入200μL裂解液Ⅰ，懸浮沉淀，37℃放置30分鐘；

(4)加入200μL裂解液Ⅱ，20μL消化液，充分振蕩混勻，56℃水浴10分鐘；

(5)加入600μL析出液，輕輕顛倒混勻，如有半透明懸浮物，不影響RNA的提取與后續實驗；

(6)將吸附柱放入收集管內，取步驟(5)所得溶液600μL轉入吸附柱內，靜置2分鐘，12,000rpm 4℃離心1分鐘，棄收集管內廢液；

(7)將剩余400μL步驟(5)所得溶液轉入上述吸附柱內，重復操作步驟(6)；

(8)將吸附柱放回收集管內，加500μL洗滌液至吸附柱內，12,000rpm 4℃離心1分鐘，棄收集管內廢液；

(9)將吸附柱放回收集管內，12,000rpm 4℃離心2分鐘，離去殘留的洗滌液；

(10)取出吸附柱，放入新的1.5mL離心管內，加入30-100μL洗脫液，靜置3分鐘，12,000rpm 4℃離心2分鐘，收集RNA溶液；提取的RNA-70℃保存，或直接用于下一步實驗。

4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(3)包括：

(1)先用1wt.％瓊脂糖的凝膠電泳與紫外分光光度計檢測RNA質量，用Alignent2100RNA 6000Nano Kit檢測RNA整齊度；

(2)用含15wt.％聚丙烯酰胺的變性凝膠分離小分子RNA，再用小片段RNA回收試劑盒回收并純化長度為18～30bp之間的RNA，連接5’和3’接頭進行反轉錄合成；其中，5’為5’-RACE-Ready cDNA，3’為3’-RACE-Ready cDNA；

(3)進行PCR擴增，并且構建小分子RNA的cDNA文庫。

5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(5)包括：

(a)數據質量控制

利用生物信息學軟件對小RNA測序得到的原始序列進行數據質量統計，然后根據統計結果，用過濾軟件過濾原始序列中測序質量值低于20的序列，及建庫過程中使用的3’和5’端的接頭序列；

(b)植物來源miRNA及其豐度鑒定

從公共數據庫或已發表文章中下載已知植物所有小RNA成熟序列和前體序列，利用比對軟件將過濾后的讀序比對至已知植物miRNA成熟序列，結合miRNA鑒定軟件鑒定糞便樣品中植物性miRNA的種類及豐度。