[發明專利]一種基于DNA特征序列的細菌核酸測序鑒定方法及細菌鑒定試劑盒

在審

• 申請號: 201810565692.2
• 申請日: 2018-06-04
• 公開（公告）號: CN108410971A
• 公開（公告）日: 2018-08-17
• 發明（設計）人: 馮震;蔣波;李芳;洪小栩;許華玉;秦峰;劉浩;楊美成
• 申請（專利權）人: 上海市食品藥品檢驗所
• 主分類號: C12Q1/6869
• 分類號: C12Q1/6869;C12Q1/6806;C12Q1/04;C12M1/34
• 代理公司: 上海申新律師事務所 31272
• 代理人: 俞滌炯

本發明涉及一種基于DNA特征序列的細菌核酸測序鑒定方法及試劑盒，該方法包括步驟：選取待鑒定的細菌菌株，并提取和純化其基因組DNA；PCR擴增純化后的基因組DNA的特征序列片段；提取和純化PCR擴增產物；測定純化后的PCR擴增產物的序列，并采用通用性序列拼接軟件，去除引物區，獲得相應片段的DNA序列；將相應片段的DNA序列導入標準核酸序列數據庫進行序列比對，進行細菌菌株的鑒定；其中，菌株的基因組DNA的提取和純化采用溶菌酶、十二烷基硫酸鈉、十六烷基三甲基溴化銨進行菌體破碎；采用苯酚?氯仿?異戊醇、乙醇沉淀核酸，獲得符合質量控制要求的基因組DNA。本發明可為細菌核酸測序鑒定方法提供客觀、準確的判定依據，實現細菌污染物的快速、一體化鑒定。

技術領域

本發明涉及核酸測序鑒定方法，尤其涉及一種基于DNA特征序列的細菌核酸測序鑒定方法及細菌鑒定試劑盒。

背景技術

利用分子生物學技術對藥物原料、輔料、制藥用水、中間體、終產品和環境中的污染微生物進行鑒定、分類和追溯，是加強藥品生產過程質量控制、提升產品質量與安全性、降低用藥風險的有效手段。與傳統的形態學觀察、顯微鏡檢、理化鑒別和生化分析等技術相比，分子生物學技術以生物核酸作為目標檢測物，可以從根本性的遺傳物質層面對菌株的種屬及來源做出解釋，檢測結果更加準確，靈敏度更高，特異性更強，目前已逐漸成為國、內外藥品質量標準發展的必然趨勢。目前，《美國藥典》(USP 40<1113>)、《歐洲藥典》(EP 9.0<5.1.6>)、《日本藥典》(JP 17<General Information G4>)、《中國藥典》(通則9204)中均收載了分子生物學技術用于藥品微生物質量控制的相關章節。

DNA特征序列(DNA條形碼)分子鑒定是利用基因組中一段公認的、相對較短的DNA序列來進行物種鑒定的分子生物學分類方法。該方法以核酸測序技術為基礎，通過篩選通用DNA特征序列，建立數據庫和鑒定平臺，運用生物信息學方法分析比對DNA數據，進而對物種進行鑒定，是對傳統生物鑒定方法的有效補充和重大突破，近年來受到國內外藥品質量標準制定機構的廣泛關注，并逐漸成為物種鑒定和分類的研究熱點。

16S rRNA基因全長涵蓋了最全面的菌株遺傳進化信息，但受到核酸測序方法操作性、測序質量、測序成本、核酸測序反應長度、特別是高通量核酸測序反應讀長的限制，多數文獻報道還是采用部分核酸序列(Partial Sequence)進行研究，具有鑒定和分類意義的核心區域尚待討論，如：USP40<1113>中認為16S rRNA基因5'端對于細菌“種”水平的鑒定更具有意義；Chan等研究報道在臨床分離微生物的種群鑒定時，V1～V2區更具有分類意義；Kataoka等在鏈霉素分類鑒定中采用V1～V3區作為鑒定靶點；Becker等在葡萄球菌分類鑒定中采用V1～V3區和V1～V8區的比較方法；Engelbrektson等利用Roche454核酸測序平臺研究發現V1、V2和V8區具有更多的特異性位點；Kim等借助OTUs(Operational taxonomicunits)分析的理論，認為V1～V3區和V1～V4區在微生物菌群鑒定中更有分類意義；Chakravorty等研究發現16S rRNA中V2、V3、V6區核酸序列串聯可實現多數細菌“種”水平的鑒定和分類；Lu等利用PCR和RFLP方法對于臨床腦脊液分離的微生物菌群進行了分類鑒定，認為16S rRNA中V4～V9區分辨率較低等。

目前，以16S rRNA核酸測序技術為基礎的微生物鑒定方法已經建立，并應用于臨床分離菌株的研究，但其用于藥品質量控制及藥品生產環境中常見污染菌的鑒定還鮮有報道；以16S rRNA核酸測序方法進行微生物鑒定的文獻中，所選取的測序靶點和測序引物各異，符合藥品質量控制要求的具有鑒定和分類意義的DNA特征序列片段尚不清晰明確；現有研究中的核酸測序結果多數是通過Blast分析法與Genebank數據庫中的核酸序列進行比對，對于測序結果的質量核查和Genebank數據庫中序列信息的準確性關注度較小，測序結果的判定依據尚不規范統一。

發明內容