[發明專利]一種基于DNA特征序列的細菌核酸測序鑒定方法及細菌鑒定試劑盒

在審

• 申請號: 201810565692.2
• 申請日: 2018-06-04
• 公開（公告）號: CN108410971A
• 公開（公告）日: 2018-08-17
• 發明（設計）人: 馮震;蔣波;李芳;洪小栩;許華玉;秦峰;劉浩;楊美成
• 申請（專利權）人: 上海市食品藥品檢驗所
• 主分類號: C12Q1/6869
• 分類號: C12Q1/6869;C12Q1/6806;C12Q1/04;C12M1/34
• 代理公司: 上海申新律師事務所 31272
• 代理人: 俞滌炯

1.一種基于DNA特征序列的細菌核酸測序鑒定方法，其特征在于，包括如下步驟：

步驟一、選取待鑒定的細菌菌株，并提取和純化所述菌株的基因組DNA；

步驟二、采用擴增引物PCR擴增步驟一中純化后的基因組DNA的特征序列片段；

步驟三、提取和純化步驟二中獲得的PCR擴增產物；

步驟四、測定步驟二中純化后的PCR擴增產物的序列，并采用通用性序列拼接軟件，去除引物區，獲得相應片段的DNA序列；

步驟五、將步驟四所述的相應片段的DNA序列導入標準核酸序列數據庫進行序列比對，進行細菌菌株的鑒定；

其中，所述步驟一中，菌株的基因組DNA的提取和純化采用溶菌酶、十二烷基硫酸鈉、十六烷基三甲基溴化銨進行菌體破碎；采用苯酚-氯仿-異戊醇、乙醇沉淀核酸，獲得符合質量控制要求的基因組DNA。

2.根據權利要求1所述的一種基于DNA特征序列的細菌核酸測序鑒定方法，其特征在于，所述菌體破碎過程中各試劑的濃度為10mg/ml～20mg/ml溶菌酶、5％～10％(w/v)十二烷基硫酸鈉溶液、5％～10％(w/v)十六烷基三甲基溴化銨溶液。

3.根據權利要求2所述的一種基于DNA特征序列的細菌核酸測序鑒定方法，其特征在于，所述菌體破碎過程中各試劑的濃度為10mg/ml溶菌酶、5％(w/v)十二烷基硫酸鈉溶液、5％(w/v)十六烷基三甲基溴化銨溶液；或者10mg/ml溶菌酶、10％(w/v)十二烷基硫酸鈉溶液、10％(w/v)十六烷基三甲基溴化銨溶液；或者20mg/ml溶菌酶、5％(w/v)十二烷基硫酸鈉溶液、5％(w/v)十六烷基三甲基溴化銨溶液。

4.根據權利要求3所述的一種基于DNA特征序列的細菌核酸測序鑒定方法，其特征在于，所述菌株的基因組DNA的提取和純化包括如下步驟：

取適量分離純化后的菌體置于離心管中，加入適宜的緩沖液、溶菌酶，混勻、水浴加熱；加入十二烷基硫酸鈉溶液，水浴加熱；加入氯化鈉溶液、十六烷基三甲基溴化銨溶液，水浴加熱；加入飽和苯酚-氯仿-異戊醇溶液，劇烈震蕩，室溫靜置、離心，取上清液置于新的離心管中，重復操作1次；加入無水乙醇，低溫條件下靜置，離心、棄去上清液；加入70％乙醇溶液洗滌，離心、棄去上清液，室溫風干至乙醇揮發完全；加入適宜的緩沖液，混勻后作為核酸提取溶液。

5.根據權利要求3所述的一種基于DNA特征序列的細菌核酸測序鑒定方法，其特征在于，所述菌株的基因組DNA的提取和純化包括如下步驟：

取適量分離純化后的菌體置于離心管中，加入溶菌酶溶液，混勻、水浴加熱；加入十二烷基硫酸鈉溶液，水浴加熱；加入氯化鈉溶液、十六烷基三甲基溴化銨溶液，水浴加熱；將菌體裂解液轉移至適宜的載體上，通過離心的方式去除菌體及裂解液，將核酸截留在適宜的載體上，加入飽和苯酚-氯仿-異戊醇溶液，無水乙醇溶液等洗滌，離心、棄去洗滌液；室溫風干至乙醇揮發完全；加入適宜的緩沖液溶解核酸，離心將其從適宜的載體上洗脫下來，作為核酸提取溶液。

6.根據權利要求1所述的一種基于DNA特征序列的細菌核酸測序鑒定方法，其特征在于，所述步驟三中，PCR擴增產物的提取和純化方法包括如下步驟：

步驟1)取適量的擴增產物與上樣緩沖液混合在1.5％瓊脂糖凝膠中進行電泳；

步驟2)將步驟1)中結束電泳的瓊脂糖凝膠中的核酸擴增產物切下，加入適宜的緩沖液，水浴完全溶解；加入乙酸鈉溶液和乙二胺四乙酸鈉溶液，混勻；加入無水乙醇，靜置、離心、棄上清液；加入75％乙醇溶液洗滌，離心、棄上清液、將乙醇揮發完全；加入適宜的緩沖液，混勻后作為核酸擴增產物的純化溶液。

7.根據權利要求6所述的一種基于DNA特征序列的細菌核酸測序鑒定方法，其特征在于，所述步驟2)可替換為如下步驟：

將步驟1)中結束電泳的瓊脂糖凝膠中的核酸擴增產物切下，加入醋酸鈉，混勻；加入無水乙醇，混勻、離心、棄上清液；加入70％乙醇溶液，離心、棄上清液；待乙醇揮發完全后加入無菌水溶解DNA，作為核酸擴增產物的純化溶液。