[發明專利]一種構建甲基化測序文庫的方法及相應的接頭序列和試劑盒

在審

• 申請號: 201810563270.1
• 申請日: 2018-06-04
• 公開（公告）號: CN108753923A
• 公開（公告）日: 2018-11-06
• 發明（設計）人: 曹亮;束文圣;吳勝標;王璋;郝祎琪
• 申請（專利權）人: 廣州微芯生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6806
• 分類號: C12Q1/6806;C12Q1/6869;C12N15/11;C12N15/10;C40B50/06
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本發明公開了一種構建甲基化測序文庫的方法及相應的接頭序列和試劑盒。本發明接頭序列中的胞嘧啶堿基經過甲基化修飾。本發明用于構建甲基化測序文庫的接頭序列，巧妙的應用了C3～C21長碳鏈的化學修飾，應用于單鏈形成的莖環結構測序接頭，與現有的主流建庫接頭相比，有不易產生接頭二聚、無需額外進行雙鏈退火和無需使用酶打開莖環中環狀結構的優勢，在重亞硫酸鹽轉化后，在不影響后期PCR擴增的基礎上，大大的節省了反應時間和試劑成本。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種構建甲基化測序文庫的方法 及相應的接頭序列和試劑盒。

背景技術

隨著現代科學技術的發展，生命科學的研究已經進入了組學時代。基因和 基因組測序技術已經成為現代生命科學研究，特別是基因組學研究中不可或缺 的手段。近年來新一代基因組測序技術突飛猛進的發展帶來了基因組學研究的 空前繁榮。新一代測序技術已經在生命科學各個領域及農學、醫學、環境保護、 法醫等領域中得到廣泛的應用。在生物發育過程中，一個基因組可以衍生出許 多不同類型的表觀基因組，它們通過不同的基因組DNA修飾方式構成不同的表 觀遺傳信息，使有不同表型的細胞可以將其表觀遺傳信息通過復制傳遞給后代 細胞。基因組DNA甲基化作為參與范圍最廣的表觀遺傳修飾之一，一直是分子 遺傳學的研究熱點，它通過影響基因的表達和染色體結構變化來參與不同的生 長發育調控過程。第二代測序技術能夠通過全基因組研究，從而對全基因組范 圍內的5-加急胞嘧啶(5mC)進行研究。

常用的甲基化測序又被劃分為富集型和單堿基分辨率的甲基化測序兩大 類：1)富集型的甲基化測序主要通過與高甲基化區域高度親和的蛋白和抗體， 對基因組DNA進行富集，把富集后的基因組DNA進行常規的建庫，包括 MeDIP-seq和MBD-seq測序等，其使用的建庫試劑和接頭都與常規的基因組 DNA測序文庫構建一致；2)單堿基分辨率的甲基化測序，主要是通過重亞硫酸 鹽(Bisulfite)轉化，把沒有被甲基化的胞嘧啶轉化為尿嘧啶，再通過后續的PCR 反應把原有的胞嘧啶遺傳密碼改變為胸腺嘧啶，實現對是否被甲基化的胞嘧啶 進行很好的分辨，因此涉及到亞硫酸鹽轉化的甲基化測序文庫構建的試劑與普 通基因組DNA文庫構建對接頭和后續PCR用的酶有特殊的要求。

甲基化測序文庫構建常規流程包括：1)基因組DNA的分離提取及打斷；2) 檢測打斷后基因組DNA片段質量；3)基因組DNA片段末端補平；4)基因組 DNA片段3’端加A尾；5)基因組DNA片段加甲基化專用接頭；6)選擇基因 組DNA片段大小；7)重亞硫酸鹽轉化；8)PCR擴增；9)檢測基因組DNA 文庫的質量。甲基化測序文庫常用試劑為NEB Ultra系列、IlluminaTruseq系列 及Kapa Hyper系列等，甲基化專用接頭必須保證接頭上的所有胞嘧啶都是經過 甲基化修飾的，保證在重亞硫酸鹽轉化的過程中接頭的堿基序列不會產生變化， 從而影響后續的測序反應。而建庫試劑中的接頭主要有三種經典結構，包括平 端雙鏈接頭(以Thermo公司的建庫試劑為代表)、Y型結構雙鏈接頭(以Illumina 公司的建庫試劑為代表)和U型結構單鏈接頭(以NEB公司的建庫試劑為代表)。 這三種接頭的主要優勢和弊端分別為，平末端的雙鏈接頭效率中等，易形成接 頭自連；Y型結構雙鏈接頭連接效率偏低，制作工藝需要額外添加退火步驟， 而且退火前兩條單鏈的濃度及比例常因為定量問題而存在批次間產生比例失衡 而不穩定；U型結構單鏈接頭由于為單鏈結構，天然形成部分雙鏈的莖環結構， 無需額外退火，連接效率高，不易產生接頭自連，但是需要在文庫PCR擴增之 前使用酶把U型結構打開，增加實驗的步驟及試劑成本。現階段所有的接頭設 計序列上仍然受到測序上游公司的制約，而設計出連接效率高、最終文庫得率 高且步驟簡單節省試劑成本的接頭，將有利于進一步降低基因組測序文庫構建 成本，推動基因測序的不斷發展。

發明內容