[發明專利]用于熒光PCR檢測的DNA快速提取方法和亞甲基四氫葉酸還原酶基因多態性的檢測方法

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• 申請號: 201810561497.2
• 申請日: 2018-06-04
• 公開（公告）號: CN108715887A
• 公開（公告）日: 2018-10-30
• 發明（設計）人: 陳雯雯;鄭佳瑩;劉曉蕾;陳永欣
• 申請（專利權）人: 深圳大學
• 主分類號: C12Q1/6806
• 分類號: C12Q1/6806;C12Q1/6858;C12Q1/6883
• 代理公司: 廈門市精誠新創知識產權代理有限公司 35218
• 代理人: 秦華

1.一種用于熒光PCR檢測的DNA的快速提取方法，其特征在于，取檢測樣本全血加入裂解液；52-57℃下第一次孵育；92-98℃下第二次孵育；然后離心即可。

2.權利要求1所述用于熒光PCR檢測的DNA的快速提取方法，其特征在于，所述裂解液的配方為5～100mM的Tris-HCl，1～50mM的EDTA，0.01～0.5％w/v的表面活性劑，50～250μg的蛋白酶K，20～200mM的氯化銨，10～200mM的氯化鈉，pH值為6.5～8.5；優選的，表面活性劑為SDS或NP-40或Brj-35；

任選的，檢測樣本全血與裂解液的體積比為1：(8～15)；優選的，檢測樣本全血與裂解液的體積比為1：(8～12)；更優選的，檢測樣本全血與裂解液的體積比為1：11。

3.權利要求1所述用于熒光PCR檢測的DNA的快速提取方法，其特征在于，所述第一次孵育的溫度為53～56℃；優選的，第一次孵育的溫度為55℃；

任選的，所述第一次孵育的時間為8～12分鐘；優選的，第一次孵育的時間為10分鐘；

所述第一次孵育的溫度為93～97℃；優選的，第一次孵育的溫度為95℃；

任選的，第二次孵育的時間為3～8分鐘；優選的，第二次孵育的時間為5分鐘；

任選的，離心的時間為0.5～2分鐘；優選的，離心的時間為1分鐘。

4.一種亞甲基四氫葉酸還原酶基因多態性的檢測方法，其特征在于，采用權利要求1-3任一項所述方法提取DNA后進行熒光定量PCR檢測。

5.權利要求4所述亞甲基四氫葉酸還原酶基因多態性的檢測方法，其特征在于，所述熒光定量PCR的引物和探針為SEQ ID NO:1～4所示序列；

任選的，所述熒光定量PCR的20μL反應體系為：10μL的2×TaqMan Fast AdvancedMaster Mix、濃度為300nM的引物、濃度為250nM的探針、2μL待測樣本，余量為無菌水；

任選的，所述熒光定量PCR的反應程序為：50℃2min；95℃20s；95℃3s，60℃30s，循環40次；50℃1min。

6.一種用于亞甲基四氫葉酸還原酶基因多態性檢測的試劑盒，其特征在于，包括裂解液，SEQ ID NO:1-4所示序列的引物和探針。

7.權利要求6所述用于亞甲基四氫葉酸還原酶基因多態性檢測的試劑盒，其特征在于，所述裂解液的配方為5～100mM的Tris-HCl，1～50mM的EDTA，0.01～0.5％w/v的表面活性劑，50～250μg的蛋白酶K，20～200mM的氯化銨，10～200mM的氯化鈉，pH值為6.5～8.5；優選的，表面活性劑為SDS或NP-40或Brj-35。

8.一種權利要求6所述用于亞甲基四氫葉酸還原酶基因多態性檢測的試劑盒的使用方法，其特征在于，取檢測樣本全血加入裂解液；52-57℃下第一次孵育；92-98℃下第二次孵育；然后離心得到DNA；再熒光定量PCR檢測即可。