[發明專利]用于熒光PCR檢測的DNA快速提取方法和亞甲基四氫葉酸還原酶基因多態性的檢測方法

在審

• 申請號: 201810561497.2
• 申請日: 2018-06-04
• 公開（公告）號: CN108715887A
• 公開（公告）日: 2018-10-30
• 發明（設計）人: 陳雯雯;鄭佳瑩;劉曉蕾;陳永欣
• 申請（專利權）人: 深圳大學
• 主分類號: C12Q1/6806
• 分類號: C12Q1/6806;C12Q1/6858;C12Q1/6883
• 代理公司: 廈門市精誠新創知識產權代理有限公司 35218
• 代理人: 秦華

本發明公開了用于熒光PCR檢測的DNA快速提取方法和亞甲基四氫葉酸還原酶基因多態性的檢測方法。用于熒光PCR檢測的DNA的快速提取方法為取檢測樣本全血加入裂解液；52?57℃下第一次孵育；92?98℃下第二次孵育；然后離心即得到待檢DNA；然后進行熒光定量PCR檢測即可。本發明方法操作簡單，省時高效，特異型強、靈敏度高、穩定性好，適用于大規模的臨床應用。

技術領域

本發明涉及多態性檢測領域，尤其涉及用于熒光PCR檢測的DNA快速提取方法和亞甲基四氫葉酸還原酶基因多態性的檢測方法。

背景技術

亞甲基四氫葉酸還原酶(5,10-methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR)，是葉酸-甲硫氨酸代謝過程中的重要酶之一，它能使血液中的同型半胱氨酸(Hcy)維持在較低的水平。MTHFR在677位點有三種基因分型：野生型CC、雜合突變型CT和純合突變型TT。該位點發生突變，可能會使酶活性降低，影響葉酸代謝，導致血液中Hcy水平升高，從而引發心血管疾病、腦血管疾病等。因此對于高危人群，如原發性高血壓患者、伴有同型半胱氨酸升高的高血壓患者、伴有高血脂和高血糖等危險因素的高血壓患者、已經發生心腦血管疾病的患者、有心腦血管疾病家族史的人群、孕婦等進行MTHFR C677T基因多態性的檢測，能夠預防心血管疾病、腦血管疾病的發生，對于判斷高血壓種類以及后續用藥指導都具有重要意義。也可指導孕婦合理補充葉酸，預測唇腭裂、唐氏綜合癥、神經管缺陷等新生兒出生缺陷，適用于正常夫婦生育前預防性檢測。然而，傳統的MTHFR檢測方法都需要對DNA進行純化，而DNA純化過程又十分繁瑣，耗費的人力、物力、資源巨大，而且會有樣本間交叉污染的問題。

發明內容

本發明的目的在于提供一種省時高效，特異型強、靈敏度高、穩定性好，適用于大規模的臨床應用的亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)基因多態性的檢測方法。

為實現上述目的，本發明提供一種用于熒光PCR檢測的DNA的快速提取方法，其特征在于，取檢測樣本全血加入裂解液；52-57℃下第一次孵育；92-98℃下第二次孵育；然后離心即可。

進一步，所述裂解液配方為5～100mM的Tris-HCl，1～50mM的EDTA，0.01～0.5％w/v的表面活性劑，50～250μg的蛋白酶K，20～200mM的氯化銨，10～200mM的氯化鈉，pH值為6.5～8.5；優選的，表面活性劑為SDS或NP-40或Brj-35；

任選的，檢測樣本全血與裂解液的體積比為1：(8～15)；優選的，檢測樣本全血與裂解液的體積比為1：(8～12)；更優選的，檢測樣本全血與裂解液的體積比為1：11。

進一步，所述第一次孵育的溫度為53～56℃；優選的，第一次孵育的溫度為55℃；

任選的，所述第一次孵育的時間為8～12分鐘；優選的，第一次孵育的時間為10分鐘；

所述第一次孵育的溫度為93～97℃；優選的，第一次孵育的溫度為95℃；

任選的，第二次孵育的時間為3～8分鐘；優選的，第二次孵育的時間為5分鐘；

任選的，離心的時間為0.5～2分鐘；優選的，離心的時間為1分鐘。

本發明還提供一種亞甲基四氫葉酸還原酶基因多態性的檢測方法，其特征在于，采用上述方法提取DNA后進行熒光定量PCR檢測。

進一步，所述熒光定量PCR的引物和探針為SEQ ID NO:1-4所示序列；

任選的，所述熒光定量PCR的20μL反應體系為：10μL的2×TaqMan Fast AdvancedMaster Mix、濃度為300nM的引物、濃度為250nM的探針、2μL待測樣本，余量為無菌水；