[發(fā)明專利]一種不依賴輔因子的全細(xì)胞催化合成芳香化合物的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810560919.4
• 申請(qǐng)日: 2018-05-25
• 公開（公告）號(hào): CN108715826B
• 公開（公告）日: 2021-12-10
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 許平;倪俊;陶飛;吳雨桐;唐鴻志
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 上海交通大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N1/21
• 分類號(hào): C12N1/21;C12N15/70;C12P7/24;C12R1/19
• 代理公司: 上海旭誠(chéng)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 31220
• 代理人: 鄭立

本發(fā)明公開了一種不依賴輔因子的全細(xì)胞催化合成芳香化合物的方法，其特征在于，芳香化合物的催化合成是以木質(zhì)素來(lái)源的分別以阿魏酸等木質(zhì)素來(lái)源的酚酸為底物，所述全細(xì)胞為轉(zhuǎn)入芳香酚單加氧酶基因amp和酚酸脫羧酶基因pad的重組大腸桿菌，在高溫和堿性條件下，重組大腸桿菌可以將這些酚酸轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的高價(jià)值芳香化合物。這種方法用全新的全細(xì)胞催化劑來(lái)合成高價(jià)值芳香化合物，避免了輔因子的添加，大大提高了效率和節(jié)約了成本。本發(fā)明為木質(zhì)素資源的利用開辟了新的技術(shù)，具有重要的應(yīng)用前景。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及芳香化合物的合成領(lǐng)域，尤其涉及一種不依賴輔因子的全細(xì)胞催化合成芳香化合物的方法。

背景技術(shù)

近年來(lái)，基于木質(zhì)纖維素資源和農(nóng)業(yè)廢棄物的生物煉制為石化資源短缺和日益凸顯的環(huán)境問(wèn)題提供了一條綜合的解決方案。然而，傳統(tǒng)的生物煉制以及造紙行業(yè)每年會(huì)產(chǎn)生超過(guò)3億噸的木質(zhì)素廢棄物，其中，超過(guò)98％的木質(zhì)素廢棄物被用作燃燒產(chǎn)熱，這一過(guò)程造成了資源的大量浪費(fèi)以及嚴(yán)重的環(huán)境污染。隨著利用木質(zhì)纖維素來(lái)生產(chǎn)生物乙醇的生物煉制過(guò)程的快速發(fā)展，到2030年后每年將多產(chǎn)生超過(guò)2.2億噸的木質(zhì)素廢棄物，這成為了當(dāng)下生物煉制發(fā)展的最大挑戰(zhàn)。另一方面，占據(jù)木質(zhì)纖維素15％-30％量的木質(zhì)素是最大的天然芳香化合物資源，最近，對(duì)于這類可再生資源的利用受到越來(lái)越多的關(guān)注。阿魏酸和對(duì)香豆酸是木質(zhì)素中含量最大芳香單體，可以簡(jiǎn)單的通過(guò)熱化學(xué)解聚或者酶解木質(zhì)素得到。因此，為了發(fā)展更加可持續(xù)和具有競(jìng)爭(zhēng)力的生物煉制，開發(fā)將這些易獲取的木質(zhì)素來(lái)源的酚酸轉(zhuǎn)化為高價(jià)值芳香化合物的綠色技術(shù)顯得極為關(guān)鍵。阿魏酸是生物法合成香蘭素的主要原料，而對(duì)香豆酸可以用于四乙烯基苯酚的制備。香蘭素具有“香料皇后”的美譽(yù)，被廣泛的應(yīng)用于食品、香精香料、飲料及醫(yī)藥領(lǐng)域，其年需求量高達(dá)16,000噸。同時(shí)，香蘭素也越來(lái)越多的用于熱固樹脂和熱固塑料的合成。四乙烯基苯酚可以用于聚合材料的生產(chǎn)，應(yīng)用于光電導(dǎo)管和半導(dǎo)體制造領(lǐng)域。然而，包括香蘭素在內(nèi)這些高價(jià)值芳香化合物在植物中的含量非常低，同時(shí)，分離和提取過(guò)程復(fù)雜，使得它們的產(chǎn)量不能滿足日益增長(zhǎng)的需求量。化學(xué)合成法依賴于石油化工產(chǎn)品和能源，并會(huì)對(duì)生態(tài)環(huán)境造成一定危害。基于這些原因，利用阿魏酸等木質(zhì)素來(lái)源的羧酸通過(guò)生物法生產(chǎn)香蘭素等高價(jià)值芳香化合物是一條理想的途徑。

溫和的反應(yīng)條件、快速高效的生產(chǎn)過(guò)程和清潔無(wú)污染等優(yōu)勢(shì)使得微生物發(fā)酵生產(chǎn)高價(jià)值芳香化合物成為了最具潛力的合成方法。以香蘭素為例，包括鏈霉菌、芽孢桿菌、假單胞菌和大腸桿菌在內(nèi)的多種微生物可以轉(zhuǎn)化阿魏酸生成香蘭素。盡管如此，負(fù)責(zé)這類芳香羧酸轉(zhuǎn)化的阿魏酰輔酶A合酶依賴于ATP和輔酶A，因此，對(duì)于ATP和輔酶A的需求嚴(yán)重限制了阿魏酸等木質(zhì)素來(lái)源的酚酸的利用效率。Lee等人嘗試通過(guò)在大腸桿菌中構(gòu)建輔酶A循環(huán)系統(tǒng)來(lái)提高阿魏酸的轉(zhuǎn)化效率，然而能源的需求仍然限制了該途徑。最近，F(xiàn)uruya等人發(fā)現(xiàn)了一個(gè)輔酶A不依賴的脫羧酶可以將四乙烯基愈創(chuàng)木酚轉(zhuǎn)化為香蘭素，但是該酶對(duì)堿性環(huán)境的依賴使得其不能與將阿魏酸轉(zhuǎn)化為四乙烯基愈創(chuàng)木酚的酚酸脫羧酶配合使用，需要進(jìn)行兩步法反應(yīng)才能得到香蘭素。這其中，對(duì)于酸堿性條件的更換和兩種休止細(xì)胞的制備等繁瑣過(guò)程影響了該方法的應(yīng)用。同時(shí)，這個(gè)輔酶A不依賴的脫羧酶的活性很低，使得香蘭素的生產(chǎn)效率低下，不能滿足商業(yè)化的需求。因此，需要構(gòu)建新的生物轉(zhuǎn)化體系，可以在不依賴輔因子的條件下將阿魏酸和對(duì)香豆酸等木質(zhì)素來(lái)源的酚酸一步高效轉(zhuǎn)化為高價(jià)值芳香化合物。然而，目前并未有不依賴輔因子的這種生物催化劑的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容

有鑒于現(xiàn)有技術(shù)的上述缺陷，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是現(xiàn)有生物催化體系對(duì)輔因子的依賴，該依賴嚴(yán)重降低了生物轉(zhuǎn)化的效率，同時(shí)解決不依賴輔因子需要切換酸堿環(huán)境和制備多種休止的細(xì)胞的技術(shù)問(wèn)題。