[發(fā)明專利]一種不依賴輔因子的全細胞催化合成芳香化合物的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810560919.4
• 申請日: 2018-05-25
• 公開（公告）號: CN108715826B
• 公開（公告）日: 2021-12-10
• 發(fā)明（設計）人: 許平;倪俊;陶飛;吳雨桐;唐鴻志
• 申請（專利權）人: 上海交通大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/70;C12P7/24;C12R1/19
• 代理公司: 上海旭誠知識產(chǎn)權代理有限公司 31220
• 代理人: 鄭立

1.一種不依賴輔因子的全細胞催化合成芳香化合物的方法，其特征在于，所述芳香化合物的催化合成是以木質素來源的阿魏酸為底物，所述芳香化合物為香蘭素；所述全細胞為轉入芳香酚單加氧酶基因amp和酚酸脫羧酶基因pad的重組大腸桿菌，所述香酚單加氧酶基因amp來源于Thermothelomyces thermophila，蛋白序列為SEQ ID NO.1，所述酚酸脫羧酶基因pad來源于凝結芽孢桿菌Bacillus coagulans，蛋白序列為SEQ ID NO.2，具體包括如下步驟：

第一步：重組質粒的構建，將芳香酚單加氧酶基因amp和酚酸脫羧酶基因pad連接入大腸桿菌表達質粒中，

第二步：基因工程菌的構建，將重組質粒轉入大腸桿菌中，篩選并驗證陽性大腸桿菌重組菌株；

第三步：全細胞催化液反應液制備，活化并誘導細胞表達芳香酚單加氧酶和酚酸脫羧酶，離心后用的NaHCO₃/Na₂CO₃堿性緩沖液重懸菌體，獲得全細胞催化反應液；

第四步：以木質素來源的所述阿魏酸為底物，以全細胞催化劑生產(chǎn)所述芳香化合物香蘭素。

2.如權利要求1所述的不依賴輔因子的全細胞催化合成芳香化合物的方法，其特征在于，所述芳香酚單加氧酶基因amp和酚酸脫羧酶基因pad根據(jù)大腸桿菌密碼子的偏好性進行優(yōu)化，所述優(yōu)化后的序列分別為SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4。

3.如權利要求1所述的不依賴輔因子的全細胞催化合成芳香化合物的方法，其特征在于，所述第三步中NaHCO₃/Na₂CO₃堿性緩沖液的pH為9.5。

4.如權利要求1所述的不依賴輔因子的全細胞催化合成芳香化合物的方法，其特征在于，所述第四步具體包括：向全細胞催化反應液中加入終濃度為100mM的所述阿魏酸，45-50℃攪拌16-20h，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至2以下，加入等體積乙酸丁酯，混勻后室溫靜置1.5-2.5小時，離心后得到的上層液體含有的產(chǎn)物為所述香蘭素。

5.如權利要求4所述的不依賴輔因子的全細胞催化合成芳香化合物的方法，其特征在于，所述離心的轉速為5000rpm，離心時間為15min，攪拌溫度為50℃。

6.一種按照權利要求1-5任意一項所述的不依賴輔因子的全細胞催化合成芳香化合物的方法在合成芳香化合物香蘭素中的應用。