[發明專利]小分子誘導可誘導多能性干細胞分化為睪丸間質細胞的方法

有效

• 申請號: 201810558778.2
• 申請日: 2018-06-01
• 公開（公告）號: CN108795843B
• 公開（公告）日: 2021-10-08
• 發明（設計）人: 郭曉令;葛仁山;李超;陳顯武;陳勇;李曉珩
• 申請（專利權）人: 溫州醫科大學附屬第二醫院;溫州醫科大學附屬育英兒童醫院
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071
• 代理公司: 溫州名創知識產權代理有限公司 33258
• 代理人: 陳加利

本發明公開了一種小分子誘導可誘導多能性干細胞分化為睪丸間質細胞的方法，包括如下步驟：①獲取人源可誘導多能性干細胞；②使用不含有堿性成纖維細胞生長因子的E7培養基對人源可誘導多能性干細胞進行預處理培養；③使用分化培養基并結合小分子誘導劑誘導人源可誘導多能性干細胞進行分化，小分子誘導劑包括有DHH激動劑SAG、22R?OHC、氯化鋰、人血小板衍生生長因子AA、成纖維生長因子2、胰島素樣生長因子1、雄激素、促黃體生成素、視黃醇和八溴環磷酸腺苷；④手工剔除克隆團樣雜細胞；⑤剔除雜細胞后剩下的細胞用富集培養基繼續培養，富集培養基定期更換，最終獲得目標睪丸間質細胞。

技術領域

本發明涉及一種誘導可誘導多能性干細胞分化為睪丸間質細胞的方法，尤其涉及一種由小分子誘導人源可誘導多能性干細胞分化為睪丸間質細胞的方法。

背景技術

男性生殖健康離不開生殖系統的功能健全。目前，雄激素缺乏癥的治療方法僅停留在雄激素替代治療。然而，長期的雄激素治療會引起肝腎功能損傷、免疫力降低、水鈉潴留等并發癥，而且不受自身晝夜節律的調控。雖然睪丸間質細胞移植可以避免外源性雄激素替代治療帶來的某些并發癥，但是睪丸間質細胞來源不足和異體移植可能導致宿主免疫排斥反應限制了睪丸間質細胞在臨床上的應用。

目前，誘導全能干細胞或成體干細胞分化為睪丸間質細胞作為供體移植是國際上公認的解決上述問題的突破口。全能干細胞，如胚胎干細胞雖然是一種很好的種子細胞，它理論上能被誘導分化為各種類型的細胞，包括睪丸間質細胞。但是，在臨床應用中，胚胎干細胞面臨著由于涉及人體胚胎存在倫理學問題，同時也無法克服免疫排斥反應的問題。

可誘導多能性干細胞是一種類似于胚胎干細胞的多能性干細胞。可誘導多能性干細胞既具備了胚胎干細胞一樣的多能性，同時它可以從任何一種來自患者自體細胞重編程獲取，徹底規避了胚胎干細胞應用中所面臨的免疫排斥和倫理學問題，具備了巨大的臨床應用價值。

現有技術中，還未有出現通過小分子將此可誘導多能性干細胞誘導分化為睪丸間質細胞的方法。因此，本發明人對此提出了本申請的技術方案。

發明內容

本發明的目的是誘導可誘導多能性干細胞分化為睪丸間質細胞的方法，尤其是一種由小分子作為誘導劑對可誘導多能性干細胞進行誘導，使之分化為睪丸間質細胞的方法。

所述可誘導多能干細胞是指人源可誘導多能性干細胞，具體方法包括如下步驟：

①獲取人源可誘導多能性干細胞；

②使用不含有堿性成纖維細胞生長因子的E7培養基對人源可誘導多能性干細胞進行預處理培養；

③使用分化培養基培養并結合小分子誘導劑誘導人源可誘導多能性干細胞進行分化，小分子誘導劑包括有DHH激動劑SAG、22R-OHC、氯化鋰、人血小板衍生生長因子AA、成纖維生長因子2、胰島素樣生長因子1、雄激素、促黃體生成素、視黃醇和八溴環磷酸腺苷

④手工剔除克隆團雜細胞；

⑤剔除所述雜細胞后剩下的細胞用富集培養基繼續培養，所述富集培養基定期更換，最終獲得目標睪丸間質細胞。

為進一步完善上述方案，本發明進一步設置為：步驟①中所述人源可誘導多能性干細胞由人源尿液細胞重編程來源的可誘導多能性干細胞經細胞培養獲得，具體方法包括如下步驟：將人源尿液細胞重編程來源的可誘導多能性干細胞接種在質量體積比1%基質膠處理過（至少37℃孵育1小時以上）的6孔板上，并置于37℃二氧化碳培養箱內培養，每天全量更換新鮮的E8培養基，發現有分化的細胞及時挑走，每間隔6天傳代一次，傳代稀釋比例為6:1，在每次傳代后的第1天，培養基中需要添加10 μM Y-27632。