[發明專利]小分子誘導可誘導多能性干細胞分化為睪丸間質細胞的方法

有效

• 申請號: 201810558778.2
• 申請日: 2018-06-01
• 公開（公告）號: CN108795843B
• 公開（公告）日: 2021-10-08
• 發明（設計）人: 郭曉令;葛仁山;李超;陳顯武;陳勇;李曉珩
• 申請（專利權）人: 溫州醫科大學附屬第二醫院;溫州醫科大學附屬育英兒童醫院
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071
• 代理公司: 溫州名創知識產權代理有限公司 33258
• 代理人: 陳加利

1.一種小分子誘導可誘導多能性干細胞分化為睪丸間質細胞的方法，其特征在于：所述可誘導多能干細胞是指人源可誘導多能性干細胞，具體方法包括如下步驟：①獲取所述人源可誘導多能性干細胞；②使用不含有堿性成纖維細胞生長因子的E7培養基對所述人源可誘導多能性干細胞進行預處理培養；③使用分化培養基并結合小分子誘導劑誘導所述人源可誘導多能性干細胞進行分化，所述小分子誘導劑包括有DHH激動劑、22R-OHC、氯化鋰、人血小板衍生生長因子AA、成纖維生長因子2、胰島素樣生長因子1、雄激素、促黃體生成素、視黃醇和八溴環磷酸腺苷；④手工剔除克隆團樣雜細胞；⑤剔除所述雜細胞后將剩下的細胞用富集培養基繼續培養，所述富集培養基定期更換,最終獲得目標睪丸間質細胞；

步驟②至⑤具體如下：

所述的克隆團樣iPSC達到70%融合時，定義此時間點為第-2天，此時細胞培養基換成不含bFGF的E7培養基進行培養，預處理2天，定義此時時間點為第0天，然后將培養基換成分化培養基iPSC-DIM：DMEM/F12、體積百分比1% 牛血清白蛋白BSA、5 mM ITS和5 ng/mL LH，從第0至7天，在分化培養基中加入0.2μM SAG、5μM 22R-OHC和5 mM LiCl進行早期分化誘導，從第7至10天，在分化培養基中加入5 ng/mL PDGF-AA和5 ng/mL FGF2進行早期促增殖誘導；

從第10至17天，在分化培養基中加入5 ng/mL PDGF-AA、5 nM IGF-1和10 μM Androgen進行中期分化誘導，從第17至20天，在分化培養基中加入10 ng/mL PDGF-AA和10 ng/mLFGF2進行中期促增殖誘導，從第20至25天，在分化培養基中加入5 ng/mL LH、0.5 mM RA和1mM 8Br-cAMP進行晚期成熟分化誘導，期間培養基每兩天更換一次，然后通過手工富集的方式，剔除克隆團iPSC樣的雜細胞；

剩下的細胞用富集培養基繼續培養5天，富集培養基主要含有：DMEM/HG、體積百分比5%FBS、體積百分比2.5% HS、1×Sodium pyruvate、1×GlutaMAX和體積百分比1% P/S，期間培養基每兩天更換一次。

2.根據權利要求1所述的小分子誘導可誘導多能性干細胞分化為睪丸間質細胞的方法，其特征在于：步驟①中所述人源可誘導多能性干細胞由人源尿液細胞重編程來源的可誘導多能性干細胞經細胞培養獲得，具體方法包括如下步驟：將人源尿液細胞重編程來源的可誘導多能性干細胞接種在質量體積比1%的基質膠處理過且至少37℃孵育1小時以上的6孔板上，并置于37℃二氧化碳培養箱內培養，每天全量更換新鮮的E8培養基，發現有分化的細胞及時挑走，每間隔6天傳代一次，傳代稀釋比例為6:1，在每次傳代后的第1天，培養基中需要添加10 μM Y-27632。

3.根據權利要求1或2所述的小分子誘導可誘導多能性干細胞分化為睪丸間質細胞的方法，其特征在于：在獲取所述人源可誘導多能性干細胞過程中，為減少對人源可誘導多能性干細胞的損傷，傳代時使用質量體積比0.25% EDTA處理3-5分鐘，當克隆團邊緣部分開始卷起并快脫離培養皿底部時，用不含Mg²⁺離子的PBS洗1遍，然后用1 mL的 E8培養基輕輕吹打且吹打次數不超過10次，收集細胞接種到新的被質量體積比1%基質膠預處理過且至少37℃孵育1小時以上的6孔板上繼續培養。

4.根據權利要求1所述的小分子誘導可誘導多能性干細胞分化為睪丸間質細胞的方法，其特征在于：對富集培養基中所培養的目標睪丸間質細胞進行鑒定，鑒定的方法包括免疫熒光鑒定、逆轉錄PCR檢測和蛋白印記檢測。