[發明專利]一種鰱鳙通用微衛星熒光多重PCR的方法

在審

• 申請號: 201810557528.7
• 申請日: 2018-06-01
• 公開（公告）號: CN108753987A
• 公開（公告）日: 2018-11-06
• 發明（設計）人: 傅建軍;董在杰;朱文彬;方敏
• 申請（專利權）人: 中國水產科學研究院淡水漁業研究中心
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 無錫市大為專利商標事務所(普通合伙) 32104
• 代理人: 殷紅梅;張仕婷

本發明涉及一種鰱鳙通用微衛星熒光多重PCR的方法，屬于水產養殖領域中水產動物種質鑒定技術領域。其首先收集收集鰱鳙鰭條樣本，并采用傳統酚?氯仿的方法提取基因組DNA，隨后根據目的擴增片段長度差異的要求涉及引物對，選取擴增條帶清晰的3組4重PCR體系，共涉及12個微衛星標記，最后對引物進行熒光修飾及擴增驗證。本發明所述多重PCR方法，具有操作快捷、實施簡便、費用低廉等特點，可為鰱鳙種質遺傳評估和家系選育等研究提供一種新的分子標記輔助技術。

技術領域

本發明涉及一種鰱鳙通用微衛星熒光多重PCR的方法，適用于鰱鳙群體遺傳變異和親子鑒定等研究，屬于水產養殖領域中水產動物種質鑒定技術領域。

背景技術

鰱(Hypophthalmichthys molitrix)和鳙(Hypophthalmichthys nobilis)為鯉科魚類中的近緣物種，作為中國重要土著魚類，廣泛分布于各大江河湖泊中。兩者均屬慮食性魚類，是凈水漁業的重要生物資源，在目前水環境保護和治理中具有重要生態價值。同時，兩者作為中國傳統大宗淡水魚養殖品種，具有悠久的養殖歷史，養殖體量大，在中國淡水漁業中占有極其重要的經濟地位。因此，對鰱鳙種質資源的有效保護和利用具有重要意義。然而，受水利設施建設、環境污染、過度捕撈等影響，鰱和鳙的野生資源受到嚴重沖擊，近年來野生資源量呈急劇下降趨勢。此外，由于成魚個體大、繁殖周期長等特點，兩種魚的選育實施難度較大，在其養殖業中良種覆蓋率較低，親本來源對野生資源的依賴程度較大。目前，鳙尚未獲得選育良種，且養殖群體正面臨生長減慢、抗病力下降和遺傳多樣性降低等種質退化的風險。因此，開展對鰱鳙的群體種質評估，并基于群體資源開展品種改良和選育工作，有助于減少對野生資源的依賴，并為其漁業養殖的可持續發展提供保障。

中國魚類遺傳育種工作開展較多，并有很多成功案例，對中國水產養殖業健康可持續發展起到重要支撐作用。其中，群體選育是開展水產動物育種最簡單的方法，主要基于目標性狀和表型進行逐代選擇，相對省時省力，在許多環境下可獲得較快遺傳進展，被廣泛應用于魚類育種；且在群體選育中，通常涉及一些種群間(或群體)間的交配組合涉及。鰱和鳙在中國廣泛分布，具有較多的地域種群(或群體)，可為開展其遺傳改良研究提供物質基礎。此外，家系選育也是魚類遺傳改良中常用的育種技術，通過建立大量家系，掌握繁殖后代的家系數和系譜關系，有利于逐代選擇中的交配方案制定，可有效降低近交概率并提高選擇壓力。然而，鰱鳙的親本個體大、保種成本高、構建大量家系比較困難，加之鰱鳙的產卵量大，繁殖行為基礎數據匱乏，目前尚未見報道有群體或家系選育相關工作的開展。

針對以上提及的實際問題，本發明設想借助微衛星分子標記(microsatellite)開展鰱鳙的群體遺傳研究和親子鑒定等研究。一方面，可以了解目前鰱鳙的種質資源遺傳現狀，為開展選育工作提供背景數據；另一方面，通過構建親子鑒定技術，為開展家系選育提供技術支持。在過去的幾十年里，對中國鰱鳙群體的野生資源的遺傳多樣性研究也有較多開展，如基于形態學、同工酶和分子標記等方面的遺傳比較，可為開展群體選育提供基礎參考；其中也有采用微衛星標記開展的群體遺傳研究，但檢測技術多采用聚丙烯酰胺凝膠電泳技術，在分辨率和準確性上存在提高和改進的空間。而微衛星標記作為動物系譜鑒定常用的分子標記，在鰱鳙的親子鑒定研究中尚未見報道；因此，篩選適合的微衛星標記并用于構建鰱鳙親子鑒定技術具有重要的現實意義。

近年來，隨著分子檢測技術的不斷發展，對微衛星標記等位基因的分型技術也越來越精確和高效，已由傳統的瓊脂糖凝膠電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳的檢測方法，逐步發展到毛細管電泳檢測技術；其中，結合應用熒光基團(FAM和HEX等)修飾引物和高密度DNA內參標記(GS500和ROX500等)開展的測序儀毛細管電泳檢測技術越來越多被用于微衛星標記的分型中，具有分辨率高、準確率高、重復性好和便于高通量檢測等優點。此外，隨著生物試劑穩定性的不斷提高，多重PCR技術的摸索和構建也越來越便利，該方法也逐漸被應用于微衛星標記的擴增中，能有效提高實驗效率并降低實驗成本。