[發明專利]一種鰱鳙通用微衛星熒光多重PCR的方法

在審

• 申請號: 201810557528.7
• 申請日: 2018-06-01
• 公開（公告）號: CN108753987A
• 公開（公告）日: 2018-11-06
• 發明（設計）人: 傅建軍;董在杰;朱文彬;方敏
• 申請（專利權）人: 中國水產科學研究院淡水漁業研究中心
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 無錫市大為專利商標事務所(普通合伙) 32104
• 代理人: 殷紅梅;張仕婷

1.一種鰱鳙通用微衛星熒光多重PCR的方法，其特征是：首先收集收集鰱鳙鰭條樣本，并采用傳統酚-氯仿的方法提取基因組DNA，隨后根據目的擴增片段長度差異的要求涉及引物對，選取擴增條帶清晰的3組4重PCR體系，共涉及12個微衛星標記，最后對引物進行熒光修飾及擴增驗證。

2.權利要求1所述鰱鳙通用微衛星熒光多重PCR的方法，其特征是所述3組4重PCR體系具體如下：

體系1：包括4個微衛星位點，分別為Arsd684、Hysd61-5、Hysd9-2和Arsd549；體系2：包括4個微衛星位點，分別為Arsd380、Arsd443、Hysd3112-1和Arsd639；體系3：包括4個微衛星位點，分別為Hym435、Arsd86、Arsd291和Arsd99。

3.權利要求1所述鰱鳙通用微衛星熒光多重PCR的方法，其特征是所述3組4重PCR體系中采用的引物對核苷酸序列具體如下：

體系1：

Arsd684位點正向引物如SEQ ID NO.1所示，Arsd684位點反向引物如SEQ ID NO.2所示；

Hysd61-5位點正向引物如SEQ ID NO.3所示，Hysd61-5位點反向引物如SEQ ID NO.4所示；

Hysd9-2位點正向引物如SEQ ID NO.5所示，Hysd9-2位點反向引物如SEQ ID NO.6所示；

Arsd549位點正向引物如SEQ ID NO.7所示，Arsd549位點反向引物如SEQ ID NO.8所示；

體系2：

Arsd380位點正向引物如SEQ ID NO.9所示，Arsd380位點反向引物如SEQ ID NO.10所示；

Arsd443位點正向引物如SEQ ID NO.11所示，Arsd549位點反向引物如SEQ ID NO.12所示；

Hysd3112-1位點正向引物如SEQ ID NO.13所示，Hysd3112-1位點反向引物如SEQ IDNO.14所示；

Arsd639位點正向引物如SEQ ID NO.15所示，Arsd639位點反向引物如SEQ ID NO.16所示；

體系3：

Hym435位點正向引物如SEQ ID NO.17所示，Hym435位點反向引物如SEQ ID NO.18所示；

Arsd86位點正向引物如SEQ ID NO.19所示，Arsd86位點反向引物如SEQ ID NO.20所示；

Arsd291位點正向引物如SEQ ID NO.21所示，Arsd291位點反向引物如SEQ ID NO.22所示；

Arsd99位點正向引物如SEQ ID NO.23所示，Arsd99位點反向引物如SEQ ID NO.24所示。

4.如權利要求1所述鰱鳙通用微衛星熒光多重PCR的方法，其特征是具體步驟如下：

（1）鰱鳙樣本采集及DNA的制備：分別收集鰱鳙鰭條樣本，保存于無水乙醇中；采用酚-氯仿的方法提取基因組DNA，通過濃度為1.0%~1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測質量和純度，利用紫外分光光度儀測量核酸濃度，最終稀釋至20~50ng/μL，并保存于0~4℃備用；長期保持需凍存于-18~-20℃；

（2）熒光修飾及PCR擴增：在權利要求3所述引物對中的正向引物5'端進行FAM或HEX熒光基團修飾，并以步驟（1）獲得DNA為模板，按照權利要求2所述3組4重PCR體系進行PCR擴增，擴增產物經濃度為2.0%~2.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后，進行等位基因分型。

5.如權利要求4所述鰱鳙通用微衛星熒光多重PCR的方法，其特征是：所述PCR擴增時，為避免相鄰位點的擴增條帶出現重疊，目的擴增片段長度分為100~180bp、180~260bp、260~340bp和340~420bp的4個不同區間長度。