[發明專利]一種鐵線蓮葉斑病致病菌的篩選方法

在審

• 申請號: 201810554929.7
• 申請日: 2018-05-31
• 公開（公告）號: CN108641963A
• 公開（公告）日: 2018-10-12
• 發明（設計）人: 宋微;王磊;張虎;楊廣榮;周莉;劉夢
• 申請（專利權）人: 江蘇農林職業技術學院
• 主分類號: C12N1/04
• 分類號: C12N1/04;C12N1/14;C12R1/645;C12R1/77
• 代理公司: 南京蘇高專利商標事務所(普通合伙) 32204
• 代理人: 李倩

本發明公開了一種鐵線蓮葉斑病致病菌的篩選方法，取帶有褐色壞死斑的成熟鐵線蓮葉片培養致病菌懸浮液；以加入100u/mL青霉素的PDA培養基制備初篩培養基；用無菌生理鹽水稀釋致病菌懸液成不同濃度，取1mL稀釋液涂布于初篩培養基上，并在24～26℃條件下培養72～76h，獲得致病菌落群；挑取初篩培養基上長出的菌落至含10％鐵線蓮汁的PDA培養基中進行純培養，連續分離3～5次，獲得的單一菌落即為鐵線蓮葉斑病菌落。本發明方法選擇性強，分離效果好，純化率高。

技術領域

本發明涉及一種園林植物病原菌分離方法，尤其涉及一種鐵線蓮葉斑病致病菌的分離方法，屬于植物保護技術領域。

背景技術

鐵線蓮(Clematis florida Thunb.)為毛茛科鐵線蓮屬植物，多為木質藤本，是攀援綠化中不可缺少的良好材料，有些鐵線蓮的花枝、葉枝與果枝，還可作為瓶飾、切花等。近年來，隨著城市現代化建設的發展和城市規模的不斷擴大，人們的生態意識和環境意識逐漸增強。園林綠化在城市環境中起著重要的作用。要提高城市的綠化覆蓋率，改善城市的環境質量，不僅需要平面綠化，還要把平面綠化和垂直綠化有機的結合起來，因此鐵線蓮作為構成垂直綠化主體的藤本植物之一，可在園林綠化中充分發揮其優勢。但鐵線蓮的葉斑病嚴重影響其觀賞性，篩選并鑒定出導致鐵線蓮葉斑病的主要病原物，對建立有效的鐵線蓮葉斑病防治技術具有重要意義。

發明內容

發明目的：本發明的目的在于針對現有技術的不足，提供一種鐵線蓮葉斑病致病菌的篩選方法，該方法分離周期短，純化率高。

為解決上述技術問題，本發明所采用的技術手段為：

一種鐵線蓮葉斑病致病菌的篩選方法，包括如下步驟：

步驟1，致病菌懸液的制備：取帶有葉斑的鐵線蓮葉片，切碎后置無菌生理鹽水中，混合物溶液的濃度為20～25％，于一定溫度下培養得到致病菌懸液；

步驟2，初篩培養基的制備：往PDA培養基中加入100u/mL青霉素，混合均勻后，滅菌，得到初篩培養基；

步驟3，致病菌落群培養：將步驟1中的致病菌懸液用無菌生理鹽水梯度稀釋成各個濃度的稀釋液，每個濃度下取1mL稀釋液涂布于步驟2的初篩培養基上進行培養，獲得致病菌落群；

步驟4，單菌落培養：挑取初篩培養基上長出的菌落，接種至含鐵線蓮汁的培養基中進行純培養，反復分：3～5次，獲得的單一菌落為致病菌落；

步驟5：從初篩菌種中篩選出鐵線蓮葉斑病致病菌，再進行鑒定，確定致病菌的種類。

其中，步驟1中，致病菌懸液的培養條件為：于25℃，2500rpm振蕩條件下培養30～35min。

其中，步驟2中，滅菌條件為121℃下滅菌25～30min。

其中，步驟3中，對致病菌懸液進行梯度稀釋，得到的梯度稀釋液濃度為10^-5、10^-6、10^-7。

其中，步驟3中，培養條件為24～26℃下培養72～78h。

其中，步驟4中，含鐵線蓮汁的培養基中，鐵線蓮汁的質量濃度為10～15％。

其中，步驟5中，篩選方法為培養基驗證和鐵線蓮驗證試驗。

其中，步驟5中，致病菌的種屬為：鐮刀菌屬、尖鐮孢菌和鏈格飽屬。

有益效果：本發明鐵線蓮葉斑病致病菌的篩選方法選擇性強，分離周期短，純化率高。

附圖說明

圖1為本發明方法分離獲得的4類鐵線蓮葉斑病致病菌(真菌)菌落形態圖。

具體實施方式