[發(fā)明專利]一種特發(fā)性基底節(jié)鈣化致病基因突變小鼠模型的構(gòu)建

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810552675.5
• 申請(qǐng)日: 2018-05-31
• 公開（公告）號(hào): CN110551691A
• 公開（公告）日: 2019-12-10
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉靜宇;徐旋;王程
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 華中科技大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N5/10
• 分類號(hào): C12N5/10;C12N15/873;A01K67/027
• 代理公司: 42201 華中科技大學(xué)專利中心
• 代理人: 夏惠忠

本發(fā)明提供了一種特發(fā)性基底節(jié)鈣化致病基因Slc20a2?c.[1805C>G；1806C>G]突變小鼠模型及其構(gòu)建方法，并將一種突變雜合小鼠精子Slc20a2?c.[1805C>G；1806C>G]保藏在位于武漢大學(xué)內(nèi)的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為：CCTCC NO：C2017256，實(shí)驗(yàn)證實(shí)本發(fā)明構(gòu)建的特發(fā)性基底節(jié)鈣化致病基因突變小鼠模型模擬了人類特發(fā)性基底節(jié)鈣化(IBGC)患者的系列臨床表型，說(shuō)明IBGC疾病小鼠模型構(gòu)建成功，為篩選用于治療特發(fā)性基底節(jié)鈣化(IBGC)疾病的藥物奠定了基礎(chǔ)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬生命科學(xué)領(lǐng)域，涉及一種致病基因突變小鼠模型及其構(gòu)建方法，具體涉及特發(fā)性基底節(jié)鈣化致病基因突變敲入小鼠模型及其構(gòu)建方法。

背景技術(shù)

特發(fā)性基底節(jié)鈣化(Idiopathic basal ganglia calcification，IBGC)是一種以基底節(jié)及大腦其他部位鈣化為特征的神經(jīng)系統(tǒng)遺傳疾病，俗稱Fahr病。患者多在30～60歲之間發(fā)病，可出現(xiàn)帕金森樣癥狀、共濟(jì)失調(diào)、肌張力障礙、癡呆、記憶力下降、精神錯(cuò)亂、情感障礙、癲癇和頭痛等癥狀。IBGC鈣化在CT上表現(xiàn)為卵圓形或八字形高密度影，多呈對(duì)稱性，常見累及部位有尾狀核、齒狀核、腦白質(zhì)、丘腦、皮質(zhì)、中腦、腦橋等。基底節(jié)鈣化是臨床CT檢查中一種常見的征象，發(fā)生率為1％～20％，且隨著年齡的增加而升高。甲狀旁腺功能減退、微生物感染、年齡、腫瘤、外傷、中毒等多種因素均可引發(fā)基底節(jié)鈣化，但I(xiàn)BGC患者顱內(nèi)鈣化的發(fā)生與上述因素?zé)o關(guān)，其血清生化指標(biāo)如血磷、血鈣、甲狀旁腺激素(PTH)、堿性磷酸酶(ALP)、1,25(OH)₂D、成纖維生長(zhǎng)因子23(FGF23)等均正常。

IBGC疾病多以常染色體顯性方式(Autosomal dominant,AD)遺傳，具有高度遺傳異質(zhì)性。2008年，我們通過(guò)對(duì)一個(gè)來(lái)自中國(guó)河南的5代IBGC大家系 (HN-IBGC)進(jìn)行全基因組微衛(wèi)星標(biāo)記連鎖分析，將該家系致病基因定位在8 號(hào)染色體8p21.2-q11.23之間約25.0Mb的區(qū)域。這是一個(gè)新的IBGC致病位點(diǎn)，為進(jìn)一步尋找IBGC致病基因奠定了基礎(chǔ)。隨后，我們又收集了一個(gè)來(lái)自中國(guó)山東的IBGC大家系(SD-IBGC)，連鎖分析發(fā)現(xiàn)該家系致病基因同樣定位于上述位點(diǎn)內(nèi)，進(jìn)一步精細(xì)定位將8p21.1-q11.23縮短在8p12-q11.23(18.7Mb 物理圖距)染色體區(qū)段。對(duì)該區(qū)段內(nèi)的候選基因進(jìn)行測(cè)序，在HN-IBGC和SD- IBGC家系中分別發(fā)現(xiàn)SLC20A2基因c.1492G>A/p.G498R和 c.1802C>G/p.S601W突變，進(jìn)一步驗(yàn)證在北京、巴西和西班牙的IBGC家系中又發(fā)現(xiàn)5個(gè)新突變，分別是c.1802C>T/p.S601L、c.124_126delGTG/p.V42del、c.1409delC/p.P470Lfs*38、c.1723G>A/p.E575K和c.1784C>T/p.T595M。上述7個(gè)突變分別在各自家系中與IBGC患者共分離，在508例家系外正常漢族人群和389例歐美洲人群中不存在上述突變，在千人基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中并非SNPs。這些結(jié)果首次在遺傳上證明了SLC20A2基因突變是導(dǎo)致IBGC疾病的原因，這也是第一個(gè)IBGC疾病的致病基因。

SLC20A2基因編碼III型鈉-磷協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)體2(PiT2)，在人體內(nèi)廣泛表達(dá)。通過(guò)體外功能實(shí)驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn)，與野生型PiT2轉(zhuǎn)運(yùn)體相比，突變型(S601W, S601L,T595M,E575K,G498R和V42del)轉(zhuǎn)運(yùn)體向胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)無(wú)機(jī)磷(Pi)的活性大大降低，證實(shí)SLC20A2突變可導(dǎo)致PiT2磷轉(zhuǎn)運(yùn)障礙；但突變型轉(zhuǎn)運(yùn)體并未影響野生型轉(zhuǎn)運(yùn)體的磷轉(zhuǎn)運(yùn)功能，說(shuō)明IBGC鈣化發(fā)生的分子基礎(chǔ)為PiT2單倍劑量不足，而非顯性負(fù)效應(yīng)。該研究率先發(fā)現(xiàn)SLC20A2突變是導(dǎo)致IBGC的致病原因，并且闡明了該病的致病機(jī)制是由無(wú)機(jī)磷跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)障礙而導(dǎo)致。