[發明專利]一種特發性基底節鈣化致病基因突變小鼠模型的構建

在審

• 申請號: 201810552675.5
• 申請日: 2018-05-31
• 公開（公告）號: CN110551691A
• 公開（公告）日: 2019-12-10
• 發明（設計）人: 劉靜宇;徐旋;王程
• 申請（專利權）人: 華中科技大學
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/873;A01K67/027
• 代理公司: 42201 華中科技大學專利中心
• 代理人: 夏惠忠

1.一種突變雜合小鼠精子Slc20a2-c.[1805C>G；1806C>G]，于2017年11月9日保藏在位于武漢大學內的中國典型培養物保藏中心，保藏編號為：CCTCC NO:C2017256。

2.一種特發性基底節鈣化疾病小鼠模型，其Slc20a2基因cDNA第1805-1806位的堿基由CC突變為GG。

3.權利要求2所述的特發性基底節鈣化疾病小鼠模型在篩選用于治療特發性基底節鈣化疾病藥物中的應用。

4.一種特發性基底節鈣化疾病小鼠模型的構建方法，包括以下步驟：

(1)將小鼠Slc20a2基因cDNA第1805-1806位的堿基CC突變為GG，從而使第602位密碼子TCC突變為TGG，得到Slc20a2 Knock-in小鼠打靶載體；

(2)將打靶載體線性化后轉染ES細胞，藥物篩選出陽性ES克隆，通過顯微注射構造陽性ES克隆囊胚，得到嵌合雄鼠，將嵌合率大于50％的成熟雄鼠與雌鼠交配，獲得雙臂陽性F1代小鼠，將F1代小鼠進行自交，分別獲得野生型Slc20a2 Knock-In小鼠、雜合型Slc20a2Knock-In小鼠及純和型Slc20a2 Knock-In小鼠；

(3)取上述步驟(2)獲得的雄性可育成年雜合型Slc20a2 Knock-In小鼠，進行精子的提取，得到突變雜合小鼠精子Slc20a2-c.[1805C>G；1806C>G]，將提取的精子浸入液氮中保存；

(4)取步驟(3)中保存在液氮中的突變雜合小鼠精子Slc20a2-c.[1805C>G；1806C>G]進行復蘇，檢測精子活力正常后，取成年野生型小鼠卵子進行體外受精，再進行胚胎移植，繁殖小鼠獲得雜合型Slc20a2 Knock-In小鼠后代，通過此基因型的雌雄后代小鼠交配獲得25％的野生型(WT)Slc20a2 Knock-In小鼠、50％的雜合型Slc20a2Knock-In小鼠及25％的純和型Slc20a2 Knock-In小鼠，對所獲得的小鼠進行基因型鑒定，鑒定為純和型Slc20a2Knock-In的小鼠即為特發性基底節鈣化疾病小鼠模型。

5.根據權利要求4所述的構建方法，其特征在于，步驟(2)中所述的將打靶載體線性化后轉染ES細胞的方法是：將打靶載體線性化后通過電轉染的方法轉染ES細胞。

6.根據權利要求4所述的構建方法，其特征在于，步驟(2)中所述的雌鼠為C57BL/6J雌鼠。

7.根據權利要求4所述的構建方法，其特征在于，步驟(3)中所述的進行精子的提取和將提取的精子浸入液氮中保存具體方法是：將精子冷凍液解凍后加濃度為1uL/1mL的硫代甘油混均，提取所述的雄性可育成年雜合型Slc20a2 Knock-In小鼠的附睪于加有硫代甘油的冷凍液中，在顯微鏡下將附睪剪破使精液流出，室溫放置8-12分鐘，優選10分鐘，將小鼠精液與加有硫代甘油的冷凍液混均后裝入凍存管中，在液氮上空預冷后浸入液氮中保存。

8.根據權利要求4所述的構建方法，其特征在于，步驟(4)中所述的檢測精子活力的具體方法是：室溫條件下從液氮中取出存有所述含精子的凍存管，室溫放置15-30秒，優選20秒，37℃水浴25-35秒，優選30秒，從凍存管中取10-20uL含精子的混合液至HTF平衡液中，轉移至培養箱中放置15-60min，顯微鏡下觀察精子活力。

9.根據權利要求4所述的構建方法，其特征在于，步驟(4)中所述的對所獲得的小鼠進行基因型鑒定的具體方法是：剪取小鼠腳趾提取基因組DNA進行Sanger法測序。

10.權利要求4至9中任一項所述的構建方法獲得的特發性基底節鈣化疾病小鼠模型在篩選用于治療特發性基底節鈣化疾病藥物中的應用。