[發明專利]表面偶聯心肌肌鈣蛋白抗原的磁性高分子微球及其在檢測血清中心肌肌鈣蛋白中的應用

在審

• 申請號: 201810552662.8
• 申請日: 2018-05-31
• 公開（公告）號: CN108593938A
• 公開（公告）日: 2018-09-28
• 發明（設計）人: 徐力;郭軼;劉鴻翔;徐婉琦
• 申請（專利權）人: 吉林大學
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/531
• 代理公司: 長春吉大專利代理有限責任公司 22201
• 代理人: 劉世純;王恩遠

1.一種表面偶聯心肌特異性肌鈣蛋白抗原的磁性高分子微球，其特征在于：是取磁性高分子微球懸液1mL，其中微球的數量為1.074×10⁶～1.074×10⁷，懸液為PBS溶液，于洗滌緩沖液中磁吸洗滌，棄去上清雜質；再向其中加入20～500μL的活化緩沖液，振蕩20～40s，充分混勻后靜置3～10min，磁吸棄上清，重復活化步驟2～3次；再加入20～500μL的偶聯緩沖液、5～50μL的EDC水溶液、5～50μL的NHS水溶液，于常溫空氣振蕩培養箱孵育10～50min，磁吸棄去上清；再加入20～500μL的偶聯緩沖液和300～600ng的cTnT抗原充分混勻，于空氣振蕩培養箱孵育1～3h，期間每隔10～20min取出EP管于漩渦混勻器混勻，磁吸棄上清，PBS洗滌2～3次；然后加入300～600μL的封閉液，于空氣振蕩培養箱孵育1～3h，期間每隔10～20min取出EP管于漩渦混勻器混勻；最后磁吸去上清，加入1mL的保存緩沖液于4℃冰箱保存，得到偶聯cTnT抗原的功能化磁性高分子微球。

2.如權利要求1所述的一種表面偶聯心肌特異性肌鈣蛋白抗原的磁性高分子微球，其特征在于：磁性高分子微球為核殼式單分散聚苯乙烯磁性微球。

3.如權利要求1所述的一種表面偶聯心肌特異性肌鈣蛋白抗原的磁性高分子微球，其特征在于：EDC溶液為50mM的EDC水溶液，NHS溶液為50mM的NHS水溶液；活化緩沖液為50mM的嗎啉乙磺酸水溶液，pH＝6.0；偶聯緩沖液為50mM的嗎啉乙磺酸水溶液，pH＝5.0；洗滌緩沖液是在PBS溶液中加入0.1％(v/v)Tween 20得到；封閉緩沖液是在PBS溶液中加入0.1％(v/v)Tween 20和1％(w/v)BSA得到；保存緩沖液是在PBS溶液中加入0.01％(v/v)Tween 20、0.1％(w/v)BSA和0.05％(w/v)Na₃N得到。

4.權利要求1所述的表面偶聯心肌特異性肌鈣蛋白抗原的磁性高分子微球在檢測血清中心肌特異性肌鈣蛋白中的應用。

5.如權利要求4所述的表面偶聯心肌特異性肌鈣蛋白抗原的磁性高分子微球在檢測血清中心肌特異性肌鈣蛋白中的應用，其特征在于：是依次于微型離心管中加入表面偶聯心肌特異性肌鈣蛋白抗原的功能化磁性高分子微球懸液8μL、100μL待測血清或者cTnT抗原標準品以及100μL一抗溶液，其中cTnT標準品的濃度為0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0和100.0ng/mL，于30～50℃振蕩反應1.5～3.5h，期間每30min取出來于漩渦混勻器中混勻；之后，用PBS磁吸洗滌1～2次，加入100μL的熒光二抗溶液，于空氣振蕩器37℃孵育0.5～1.5h，600rpm；所有反應過程避光，保持熒光發光效率；取出磁吸離心，加入500μL的PBS溶液，上機檢測；檢測時，488nm激光激發微球表面的熒光二抗，在流式細胞儀的FL1通道檢測微球表面熒光信號，收集門內細胞數量為5000～6000個，每個樣品設置3個平行對照，從而獲得標準品組以及待測血清樣品組中微球表面熒光強度；然后以功能化微球-cTnT抗原復合物飽和偶聯一抗溶液的檢出熒光信號強度為陽性對照S_max，空白對照組的檢出信號強度為陰性對照組S_min，依照公式R＝[(S_n-S_min)/(S_max-S_min)]，S_n為cTnT標準品或待測血清檢出信號的強度，以R和標準品中cTnT抗原濃度制作標準曲線，進一步計算出血清樣品中待檢測cTnT抗原的濃度；其中，一抗為兔抗cTnT抗原的抗體，一抗溶液為一抗的磷酸鹽緩沖液溶液；熒光二抗為異硫氰酸標記的山羊抗兔二抗，二抗溶液為二抗的磷酸鹽緩沖液溶液。