[發明專利]一種應用于蛋白質組樣品制備的迷你蛋白反應器及其應用

有效

• 申請號: 201810550544.3
• 申請日: 2018-05-31
• 公開（公告）號: CN108645934B
• 公開（公告）日: 2021-03-30
• 發明（設計）人: 黃炳培;孟瓊
• 申請（專利權）人: 中山大學孫逸仙紀念醫院
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/06
• 代理公司: 廣州市華學知識產權代理有限公司 44245
• 代理人: 崔紅麗

本發明公開一種應用于蛋白質組樣品制備的迷你蛋白反應器及其應用，涉及分析化學領域。該迷你蛋白反應器主要由固定化金屬螯合層析IMAC磁珠和C₁₈beads組成。預計將從不到10μL血清作為樣本進行蛋白質組概況分析，并可能用于轉化研究。此方法采用串聯柱分離技術實現了蛋白質組學中復雜的樣品制備步驟，包括磷酸化蛋白質預濃縮，還原，烷基化和消化，以及脫鹽和分餾。本發明的方法易于使用、耗時短(2小時)，高通量，靈敏度高(可檢測100個磷酸化蛋白質)、重復性良好(R0.99)；是一種無論從數量還是從種類上，挖掘到最多蛋白質組數據的有效方法，推測其可應用于非標記定量磷酸化蛋白質組學的技術轉化研究。

技術領域

本發明涉及分析化學領域，特別涉及一種應用于蛋白質組樣品制備的迷你蛋白反應器及其應用。

背景技術

可逆的蛋白磷酸化和去磷酸化過程調控著生物體的很多生命活動，控制著生命體的很多生理和病理過程，例如細胞的增殖、生長、分化和凋亡以及細胞信號的轉導，細胞的凋亡等，被形象的稱為生命活動的開關；另一方面，磷酸化過程的異常都會導致一系列常見疾病，其中包括腫瘤癌癥，心臟疾病和老年癡呆癥等(1)，磷酸化激酶抑制劑在降低抗腫瘤方面的治療已被廣泛認可(2)。例如：VEGF信號轉導的主要受體包括fms樣酪氨酸激酶VEGFR-1和胎兒肝激酶插入區受體VEGFR-2。其中，VEGFR-2主要分布在腫瘤血管內皮細胞等；它的主要作用是介導VEGF的血管內皮細胞增生，趨化內皮細胞和增加血管通透性等功能，因此為腫瘤化療給藥提供血供，增加藥物遞送功能(3)。因此，磷酸化是影響蛋白功能的最主要的翻譯后修飾之一(4)，其與腫瘤的發生發展互為因果(5)。近年來進一步研究發現，腫瘤中特異性表達的磷酸化蛋白質已成為腫瘤診斷、預防和治療的潛在新靶點。因此更深層的研究腫瘤蛋白質特征及其形成機制在腫瘤診斷和治療上均具有重要生物醫學意義。已有的細胞生物學蛋白分析方法無法提供詳細的蛋白生化反應途徑的變化(6)。而目前正在發展的蛋白組學研究手段，可以在一定程度上為腫瘤新靶點的找尋提供高通量數據信息(7)。

盡管基于高分辨率質譜(MS)的蛋白質組學的技術已經趨于成熟，但蛋白質組學技術中樣品制備這個關鍵環節中，還有諸多問題亟待解決，如低豐度蛋白難以檢測、修飾的蛋白容易降解等。而這些問題均與制備過程中樣品消耗大、耗時長、處理復雜及低特異性相關。通常，標準蛋白質組學需要大量血清標本(500μL血清)。然而，大多數情況下我們獲得的標本量較少，從而限制了其功能研究(8)。因此，研究者們致力于開發高靈敏度、多數量(例如每個樣本5000個蛋白質)，同時消耗少量生物樣品的制備技術。但是，已經發表的方法不能用于痕量磷酸化蛋白的富集(9)，因此，選擇一種材料來特異性富集磷酸化蛋白是非常必要的。

胰腺導管腺癌(PDAC)是最常見的胰腺惡性腫瘤，95％患者在確診10個月內死亡。但是，對于PDAC標志性蛋白，目前應用的檢測方法由于含量低在PDAC早期無法被檢測，只有在晚期才能被發現，這也是導致胰腺癌治療失敗的主要原因(10，11)。因此，開發一種方法提高對PDAC發生相關的磷酸化標志性蛋白檢測靈敏度，以期到達早診斷、早治療，并最終提高生存率是我們的終極目標。

參考文獻：

(1)Raggiaschi R,Gotta S,Terstappen GC.PhosphoproteomeAnalysis.Bioscience Reports.2005；25(1-2):33-44.

(2)Casado P,Wilkes EH,Miraki-Moud F,Hadi MM,Rio-Machin A,Rajeeve V,etal.Proteomic and genomic integration identifies kinase and differentiationdeterminants of kinase inhibitor sensitivity in leukemia cells.Leukemia.2017.