[發明專利]一種應用于蛋白質組樣品制備的迷你蛋白反應器及其應用

有效

• 申請號: 201810550544.3
• 申請日: 2018-05-31
• 公開（公告）號: CN108645934B
• 公開（公告）日: 2021-03-30
• 發明（設計）人: 黃炳培;孟瓊
• 申請（專利權）人: 中山大學孫逸仙紀念醫院
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/06
• 代理公司: 廣州市華學知識產權代理有限公司 44245
• 代理人: 崔紅麗

1.一種利用迷你蛋白反應器制備蛋白質組學樣品的方法，其特征在于包括如下步驟：

所述的迷你蛋白反應器，包括移液器吸頭、C₁₈ beads、IMAC磁珠、適配器、Eppendorf管；移液器吸頭內從下而上依次設置有若干C₁₈ beads、若干IMAC磁珠；C₁₈ beads與IMAC磁珠相互接觸；適配器套在移液器吸頭上，適配器放在Eppendorf管上端；移液器吸頭的尖端插入至Eppendorf管內；

(1)血清樣本的采集：收集待測血清后，置于-80℃保存；

(2)富集：上樣之前，從下而上依次設置有若干C₁₈ beads、若干IMAC磁珠的移液器吸頭分別用甲醇和pH 7.2的10mM磷酸鹽緩沖液平衡；將待測血清通過70％甲醇沉淀蛋白，然后用pH 7.2的10mM磷酸鹽緩沖液復溶蛋白，作為樣品溶液，進行上樣；

(3)還原：用含20％乙腈的pH6～8的5～20mM磷酸鹽緩沖液洗滌后，注入尖端含10mM的組氨酸或甘氨酸的pH 6～8的5～20mM磷酸鹽緩沖液，并在室溫下孵育15分鐘，加二硫蘇糖醇還原蛋白質；

(4)烷基化及消化：用2mM胰蛋白酶加100mM碘乙酰胺烷基化，pH 8的100～200mM碳酸氫銨中灌注并在室溫避光孵育60分鐘，離心除去溶液；

(5)將肽從IMAC磁珠轉移至具有pH8的150～200mM Tris HCl的C₁₈beads中；用pH8的200mM Tris-HCl離心洗滌脫鹽后，用20μL梯度遞增的含ACN的pH8的200mM Tris-HCl中的溶液離心洗脫；

所述的梯度遞增為5％，20％，50％和80％；

(6)將洗脫的肽冷凍干燥，獲得蛋白質組學樣品，用于分析。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：還包括如下步驟：

(7)所獲得的蛋白質組學樣品通過Orbitrap Fusion質譜儀與QE超高壓液相色譜泵進行分析；液相色譜分離系統由一個100μm×4cm的捕獲柱和一個75μm×20cm的分析柱組成，內部填充3μm ReproSil-Pur C₁₈硅膠；

(8)用于分離的流動相是含0.1％甲酸的水和含0.1％甲酸的ACN；首先將樣品以2μL/min的流速分流到捕獲柱上，然后通過分析柱以300nL/min的流速分離；梯度設定如下：2-60min，2-90％ACN；60.1-70min，90-2％ACN，平衡18分鐘；全量程掃描m/z 350-1550；MS/MS光譜以數據依賴模式采集；串聯MS在三重四級桿質量分析儀上進行，使用1.6Da的采集間隔，標準化碰撞能量為10，動態排除時間設置為60s；

(9)用MASCOT軟件匹配肽段對應的磷酸化蛋白，針對人類Uniprot數據庫搜索原始數據；母體化合物和質譜片段質量誤差分別設定為10ppm和0.6Da；蛋白質組學胰蛋白酶消化允許最多兩次錯過；將磷酸化設定為固定修飾，同時甲硫氨酸氧化，天冬酰胺和谷氨酰胺脫酰胺作為可變修飾；

(10)根據其分子量和樣品總分數計算樣品中每種蛋白質的濃度。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：

步驟(1)中所述的待測血清為待測胰腺導管腺癌患者血清。

4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：

步驟(3)中，用含20％乙腈的pH7.2的10mM磷酸鹽緩沖液洗滌；

步驟(3)中，注入尖端含10mM的組氨酸或甘氨酸的pH7.2的10mM磷酸鹽緩沖液。

5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：

步驟(4)中，用2mM胰蛋白酶加100mM碘乙酰胺烷基化，pH 8的100mM碳酸氫銨中灌注并在室溫避光孵育60分鐘，離心除去溶液。

6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：

步驟(5)中，將肽從IMAC磁珠轉移至具有pH8的200mM Tris-HCl的C₁₈beads中。