[發明專利]檢測人WT1融合基因的試劑盒及其使用方法

在審

• 申請號: 201810549583.1
• 申請日: 2018-05-31
• 公開（公告）號: CN110551817A
• 公開（公告）日: 2019-12-10
• 發明（設計）人: 熊慧;陶慧卿;童光銓;陳嘉錚;徐任;俞浩
• 申請（專利權）人: 蘇州云泰生物醫藥科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6886
• 分類號: C12Q1/6886;C12Q1/6851
• 代理公司: 11390 北京和信華成知識產權代理事務所(普通合伙)
• 代理人: 胡劍輝

1.一種檢測人WT1融合基因的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括核酸擴增試劑，所述核酸擴增試劑包括WT1PCR反應液、內參PCR反應液和混合酶液；

其中，所述WT1PCR反應液中含有用于檢測WT1融合基因的引物和探針，所述內參PCR反應液含有用于檢測內參基因的引物和探針，所述混合酶液中含有Taq酶、UNG酶、RT酶和Rnasin；

所述用于檢測WT1融合基因的引物和探針包括由SEQ ID NO:1所示的上游引物、由SEQID NO:2所示的下游引物由SEQ ID NO:3所示的探針，所述探針的兩端標記有熒光基團；

所述用于檢測內參基因的引物和探針包括由SEQ ID NO:4所示的上游引物、由SEQ IDNO:5所示的下游引物、由SEQ ID NO:6所示的探針，所述探針的兩端標記有熒光基團。

2.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的5’端標記有FAM、3’端標記有TAMRA，SEQ ID NO:6所示核苷酸序列的5’端標記有FAM、3’端標記有TAMRA。

3.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中還包括對照品，所述對照品包括陰性對照和陽性對照，所述陰性對照為工藝用水，所述陽性對照中含有K562細胞株裂解物。

4.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中還包括參考品，所述參考品用于對目的基因和內參基因進行定量，所述參考品包括：

其中，WT1質粒DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示，內參質粒DNA的核苷酸序列如SEQID NO:8所示。

5.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒所適用的樣本選自外周血標本。

6.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述混合酶液中含有Taq酶0.6～0.9體積份，UNG酶0.1～0.3體積份，RT酶0.25～0.45體積份，Rnasin 0.2～0.3體積份；所述對照酶液中含有Taq酶0.6～0.9體積份，UNG酶0.1～0.3體積份；

優選的，所述混合酶液中含有Taq酶0.8體積份，UNG酶0.2體積份，RT酶0.375體積份，Rnasin 0.25體積份；所述對照酶液中含有Taq酶0.8體積份，UNG酶0.2體積份；

其中，UNG酶的活性單位為1U/μl，Taq酶的活性單位為5U/μl，RT酶的活性單位為200U/μl。

7.一種檢測人WT1融合基因的引物和探針，其特征在于，所述用于檢測WT1融合基因的引物和探針包括由SEQ ID NO:1所示的上游引物、由SEQ ID NO:2所示的下游引物、由SEQID NO:3所示的探針，所述探針的兩端標記有熒光基團；

優選的，還包括用于檢測內參基因的引物和探針，所述用于檢測內參基因的引物和探針包括由SEQ ID NO:4所示的上游引物、由SEQ ID NO:5所示的下游引物、由SEQ ID NO:6所示的探針，所述探針的兩端標記有熒光基團。

8.根據權利要求7所述的引物和探針，其特征在于，SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的5’端標記有FAM、3’端標記有TAMRA；SEQ ID NO:6所示核苷酸序列的5’端標記有FAM、3’端標記有TAMRA。

9.一種如權利要求1～8任一項所述的試劑盒的使用方法，其特征在于，至少包括以下步驟：

(1)樣本處理：提取RNA，得到樣本；

(2)擴增試劑配制：

將WT1PCR反應液與混合酶液混合，得到WT1PCR預混液；將內參PCR反應液與混合酶液混合，得到內參PCR預混液；

(3)加樣：從樣本、陰性對照、陽性對照、WT1參考品1～WT1參考品4、內參參考品1～內參參考品4中分別取樣，分別加入到各PCR預混液中和各內參PCR預混液中；

(4)PCR擴增；

(5)檢測。