[發明專利]檢測人WT1融合基因的試劑盒及其使用方法

在審

• 申請號: 201810549583.1
• 申請日: 2018-05-31
• 公開（公告）號: CN110551817A
• 公開（公告）日: 2019-12-10
• 發明（設計）人: 熊慧;陶慧卿;童光銓;陳嘉錚;徐任;俞浩
• 申請（專利權）人: 蘇州云泰生物醫藥科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6886
• 分類號: C12Q1/6886;C12Q1/6851
• 代理公司: 11390 北京和信華成知識產權代理事務所(普通合伙)
• 代理人: 胡劍輝

本申請涉及融合基因檢測領域，具體講，涉及一種檢測人WT1融合基因的試劑盒。本申請試劑盒采用一步法逆轉錄，即先采用特異性引物與酶將樣本中的mRNA逆轉錄成cDNA，逆轉錄后的cDNA直接進入下游的熒光定量PCR，對臨床外周血標本中的WT1基因的RNA進行定量檢測，從而輔助白血病臨床診斷并指導相關白血病患者對臨床藥物的選擇，具有高特異性、高準確性和最低檢出量的技術優勢。

技術領域

本申請涉及融合基因檢測領域，具體講，涉及一種檢測人WT1融合基因的試劑盒及其使用方法。

背景技術

白血病是造血系統的惡性腫瘤，其特征是骨髓、淋巴結等造血系統中一種或多種血細胞發生惡性增殖，并浸潤體內各組織臟器，導致正常造血組織細胞受抑制，產生各種癥狀。白血病臨床上常以發熱、出血、貧血，肝、脾、淋巴結腫大為特點。

近年臨床研究表明，約50％的白血病存在某些染色體畸變，如易位、缺失、插入等。染色體易位畸變時大部分情況下形成相關的融合基因，通過對這些融合基因的檢測和監測，有利于治療方案的確定和監測白血病微小殘留病灶。然而，還有約50％的白血病沒有特定的融合基因，因此將WT1基因作為廣譜標志物用于白血病微小殘留病灶的檢測正得到越來越多學者的認同。WT1基因在多種白血病細胞中高表達，且隨著病情的進展表達增高，對白血病預后及再復發有提示和預警作用。

WT1基因(Wilms tumor gene)是從Wilms瘤細胞分離出來的腫瘤基因。該基因主要在胚胎發生過程中表達。在成人則僅腎臟、卵巢、子宮內膜、睪丸、脾臟和正常的造血祖細胞有少量表達。該基因在血液系統中表達具有時間階段性,在早期造血細胞的分化中起重要作用。

WT1基因在初發急性白血病患者骨髓/外周血中高度表達，在正常骨髓中少量表達，在正常外周血中極低度表達，甚至檢測不到。在絕大多數急性髓細胞白血病亞型中均可發現WT1基因呈較高水平表達，大約70.0％的急性髓細胞白血病初診患者有WT1-mRNA高表達。慢粒患者隨著病情從慢性期進展到急性期，WT1基因表達水平逐漸增高。國外學者報道急性淋巴細胞白血病中WT1基因表達陽性率在47.0％～80.0％，并發現急性淋巴細胞白血病中的WT1基因表達低于急性髓細胞白血病。

目前認為WT1基因與白血病的病程轉歸關系密切：(1)治療前WT1基因高表達，誘導化療后WT1基因轉陰，停止治療時盡管原始細胞<5％，WT1基因表達亦升高；(2)WT1基因持續高表達者緩解期較短，隨即復發；(3)持續完全緩解者WT1基因水平很低或檢測不到；(4)WT1基因持續高水平或降至正常后有急劇升高，大于10^-2預示有復發可能；(5)持續低水平表達者不易復發。

WT1基因在各種類型白血病中表達均增高，測定WT1基因來檢測殘留白血病法可用于幾乎所有類型的白血病，WT1基因表達的定量檢測可評價化療或骨髓移植的療效和確定白血病細胞的殘留量，對早期預測復發及判定預后有重要的臨床意義。

白血病殘留病灶(MRD)，是指在白血病患者經誘導化療達到完全緩解后(包括骨髓移植后)，在體內殘存少量白血病細胞的狀態，需應用更敏感方法才能夠檢測出白血病細胞。

目前檢測MRD的方法多種多樣,有形態學方法、細胞培養法、單克隆抗體法、代謝酶測定、細胞遺傳學方法、分子生物學方法等,以上方法的精確度、敏感度及特異度均各不相同。近來發展較快且應用較多的為分子生物學方法：熒光原位雜交(fluorescence in situhybridization，FISH)、流式細胞術(flow cytometry，FCM)、聚合酶鏈反應(polymerasechain reaction，PCR)，三者在MRD的檢測中均占有重要地位。