[發明專利]一種MLD慢病毒載體、慢病毒及其制備方法和應用

在審

• 申請號: 201810549059.4
• 申請日: 2018-05-31
• 公開（公告）號: CN108707627A
• 公開（公告）日: 2018-10-26
• 發明（設計）人: 朱章英
• 申請（專利權）人: 深圳市免疫基因治療研究院
• 主分類號: C12N15/867
• 分類號: C12N15/867;C12N7/01;C12N5/10;A61K48/00;A61K38/17;A61P3/00;A61P25/28
• 代理公司: 北京品源專利代理有限公司 11332
• 代理人: 鞏克棟

本發明提供一種MLD慢病毒載體、慢病毒及其制備方法和應用，所述慢病毒載體為在pTYF慢病毒載體的5’端的剪接供體位點進行改造，其中，所述慢病毒載體還包括ARSA基因。本申請改造后的慢病毒載體的基礎上特異地連入ARSA基因，能夠在保障安全性的同時實現更高效的基因傳遞，使得ARSA基因在轉基因的大腦相關細胞中的表達量明顯增加，能夠更高效的完成MLD基因治療過程中正常基因的傳遞。

技術領域

本發明屬于基因工程技術領域，涉及一種MLD慢病毒載體、慢病毒及其制備方法和應用，尤其涉及一種應用改良后的慢病毒載體優化表達ARSA基因用于制備治療異染性腦白質營養不良癥的藥物。

背景技術

異染性腦白質營養不良(Metachromatic Leukodystrophy,MLD)又稱為ARSA缺失癥(arylsulfatase A deficiency)，為染色體突變的遺傳性疾病。發病原因是由于腦神經細胞中的酶arylsulfatase A(ARSA)缺失導致無法分解硫脂，使硫脂堆積在腦神經系統而損害神經細胞，尤其是少突膠質細胞和神經元細胞，并且CNS和PNS中會出現漸進性的脫髓鞘現象，其最為顯著的是漸進性的神經性功能紊亂，早期會虛弱，張力減退和口齒不清，晚期癥狀包括了說話困難，精神功能退化，肌肉張力增加，普遍或部分性發作，視力、聽力和外周神經病變下降，最后階段會發生強直性痙攣，去大腦姿勢和對周圍失去感知。發病率約為四萬分之一，而發病時間主要是根據硫脂在腦內堆積造成腦神經損害程度而定，因此MLD根據發病年齡分為三類：幼兒型、青少年型及成年型。通常來說，一個感染患者的每一個親人都有25％的幾率患此疾病，50％的幾率為無癥狀的攜帶者，25％的幾率是未患病或非攜帶者。

MLD是一種遺傳性的常染色體隱性遺傳疾病，其單基因突變造成了溶酶體堆積紊亂疾病(Lysosomal storage disease)，因此基因治療方法理論上可以實現對該病的徹底治療。在腦部直接注射攜帶正常ARSA基因的病毒載體可以直接對基因缺陷細胞進行腦內轉染，從而修復細胞，分泌出所需要的芳基硫酸酯酶A，減少腦硫脂的堆積，并可以進過交叉校正(cross correction)方式修復周圍細胞乃至整個腦部的細胞。

造血干細胞(hematopoietic stem cells，HSCs)與間質干細胞(mesenchymalstem cells,MSCs)具有多項特征使其成為基因治療中潛在的“運輸工具”，HSCs以及MSCs可從血液或者骨髓中獲得，并且具有分化成為一系列體細胞以及更新各種組織細胞的能力，所以通過體外修正的干細胞移植也是基因治療的一種重要途徑。

目前國內外應用病毒載體進行基因傳遞的基因治療方法雖然有許多，但是不同病毒載體，甚至相同載體的不同制備方法引起的基因傳遞效率差異明顯，而基因傳遞效率將直接影響疾病的治療效果。

英國的葛蘭素史克公司等機構也在嘗試應用慢病毒載體攜帶正常ARSA基因針對20名患MLD病人進行基因治療的臨床試驗，現在正在處于2期臨床數據收集階段，結果目前顯示患者在幾年內對治療有一定的效果，根據初步數據的評估，安全性是可以得到一定保障，腦部ARSA酶的活性有較大的提升，在第二次的檢測結果中，孩童的IQ超過了55，治療效果較為顯著，后續的臨床數據還在持續追蹤中。

現在大多應用細胞治療對遺傳病進行治療的方法均存在效率過低以及僅針對血液干細胞進行修飾，使得疾病治療的臨床效果始終達不到預期，因此急需能夠最大程度上提高病毒基因傳遞效率的方法來提高遺傳疾病的療效。

發明內容

針對現有技術的不足，本發明提供了一種MLD慢病毒載體、慢病毒及其制備方法和應用，所述MLD慢病毒載體轉染效率更高，穩定性更強，安全性更好。

為達此目的，本發明采用以下技術方案：

第一方面，本發明提供了一種慢病毒載體，所述慢病毒載體為在pTYF慢病毒載體的5’端的剪接供體位點進行改造，具體改造方式如下：